重度の急性呼吸症候群コロナウイルスのパパイン様プロテアーゼには、脱自由化活性があります

重度の急性呼吸症候群コロナウイルス（SARS-COV）のゲノムRNAの複製は、2つのウイルスプロテアーゼ、パパイン様プロテアーゼ（PLPRO）と3C様プロテアーゼ（3CLPRO）によって処理されるレプリカーゼポリタンパク質によって媒介されます。以前は、SARS-COV PLPROが3つの保存された切断部位でレプカーゼポリタンパク質を処理することを示しました。ここでは、蛍光共鳴エネルギー移動ベースのプロテアーゼアッセイで、トランス切断アッセイおよびペプチド基質のレプカーゼ基質を効率的に切断できるPLProの316アミノ酸酸化触媒コアドメインの同定と特性評価を報告します。9つの異なるコロナウイルスの16のパパイン様プロテアーゼドメインでバイオインフォマティクス分析を実施し、推定触媒トライアド（CYS1651-HIS1812-ASP1826）および亜鉛結合部位を特定しました。突然変異誘発の研究により、ASP1826および亜鉛結合に関与する4つのシステイン残基がSARS-COV PLPRO活性に不可欠であることが明らかになりました。SARS-COV PLPROの分子モデリングは、この触媒コアにも脱ユビキチン化活性がある可能性があることを示唆しています。2つの独立したアッセイによってPLProの脱ユビキチン化活性を測定することにより、この仮説をテストしました。SARS COV-PLPROは、ジビキチンとユビキチン-7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）基質の両方を加水分解し、ユビキチンAMCの加水分解は、PLPROレプリカゼ認識のシーケンスを模倣するペプチド基質の加水分解よりも約180倍効率が高くなります。PLPROによって認識された重要な決定要因を調査するために、3つのPLPRO切断部位のそれぞれでP6からP2 '残基の部位指向変異誘発を実行しました。PLPROは、コンセンサス切断シーケンスLXGGを認識していることがわかりました。これは、細胞脱ユビキチン化酵素によって認識されるコンセンサスシーケンスでもあります。基質認識部位のこの類似性は、SARS-COV PLPro阻害剤の開発中に考慮する必要があります。

Replication of the genomic RNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is mediated by replicase polyproteins that are processed by two viral proteases, papain-like protease (PLpro) and 3C-like protease (3CLpro). Previously, we showed that SARS-CoV PLpro processes the replicase polyprotein at three conserved cleavage sites. Here, we report the identification and characterization of a 316-amino-acid catalytic core domain of PLpro that can efficiently cleave replicase substrates in trans-cleavage assays and peptide substrates in fluorescent resonance energy transfer-based protease assays. We performed bioinformatics analysis on 16 papain-like protease domains from nine different coronaviruses and identified a putative catalytic triad (Cys1651-His1812-Asp1826) and zinc-binding site. Mutagenesis studies revealed that Asp1826 and the four cysteine residues involved in zinc binding are essential for SARS-CoV PLpro activity. Molecular modeling of SARS-CoV PLpro suggested that this catalytic core may also have deubiquitinating activity. We tested this hypothesis by measuring the deubiquitinating activity of PLpro by two independent assays. SARS CoV-PLpro hydrolyzed both diubiquitin and ubiquitin-7-amino-4-methylcoumarin (AMC) substrates, and hydrolysis of ubiquitin-AMC is approximately 180-fold more efficient than hydrolysis of a peptide substrate that mimics the PLpro replicase recognition sequence. To investigate the critical determinants recognized by PLpro, we performed site-directed mutagenesis on the P6 to P2' residues at each of the three PLpro cleavage sites. We found that PLpro recognizes the consensus cleavage sequence LXGG, which is also the consensus sequence recognized by cellular deubiquitinating enzymes. This similarity in the substrate recognition sites should be considered during the development of SARS-CoV PLpro inhibitors.