STEMループRT-PCRによるマイクロRNAのリアルタイム定量化

STEMループRTに続いてTaqMan PCR分析を使用して、新しいMicroRNA（miRNA）定量化法が開発されました。ステムループRTプライマーは、RTの効率と特異性の点で、従来のプライマーよりも優れています。Taqman miRNAアッセイは成熟miRNAに特異的であり、1つのヌクレオチドとは異なる関連するmiRNAを識別します。さらに、それらはゲノムDNA汚染の影響を受けません。正確な定量化は、ほとんどのmiRNAでわずか25 pgの総RNAで日常的に達成されます。実際、この方法の高感度、特異性、精度により、核酸精製のない単一の細胞の直接分析が可能になります。標準のTaqman遺伝子発現アッセイと同様に、Taqman miRNAアッセイは7桁のダイナミックレンジを示します。7つのマウス組織における5つのmiRNAの定量化は、細胞あたり10枚未満から30,000コピーを超えるまでの変動を示しました。この方法により、迅速で正確で敏感なmiRNA発現プロファイリングが可能になり、組織または疾患に特有の潜在的なバイオマーカーを特定して監視できます。ステムループRT-PCRは、短い干渉RNA（siRNA）などの他の小さなRNA分子の定量化に使用できます。さらに、STEMループRTプライマー設計の概念は、特異性と効率を向上させるために、小さなRNAクローニングとマルチプレックスアッセイに適用できます。

A novel microRNA (miRNA) quantification method has been developed using stem-loop RT followed by TaqMan PCR analysis. Stem-loop RT primers are better than conventional ones in terms of RT efficiency and specificity. TaqMan miRNA assays are specific for mature miRNAs and discriminate among related miRNAs that differ by as little as one nucleotide. Furthermore, they are not affected by genomic DNA contamination. Precise quantification is achieved routinely with as little as 25 pg of total RNA for most miRNAs. In fact, the high sensitivity, specificity and precision of this method allows for direct analysis of a single cell without nucleic acid purification. Like standard TaqMan gene expression assays, TaqMan miRNA assays exhibit a dynamic range of seven orders of magnitude. Quantification of five miRNAs in seven mouse tissues showed variation from less than 10 to more than 30,000 copies per cell. This method enables fast, accurate and sensitive miRNA expression profiling and can identify and monitor potential biomarkers specific to tissues or diseases. Stem-loop RT-PCR can be used for the quantification of other small RNA molecules such as short interfering RNAs (siRNAs). Furthermore, the concept of stem-loop RT primer design could be applied in small RNA cloning and multiplex assays for better specificity and efficiency.