[Hnrage遺伝子の組換えアデノウイルスベクターの構築と293細胞の細胞周期への影響]

目的：HNRAGE遺伝子の組換えアデノウイルスベクターを構築し、293細胞の細胞周期にその効果を研究する。 方法：HNRAGE遺伝子をPCRによって増幅し、シャトルベクターPadTrack-CMVにサブクローニングして、シャトルプラスミドPadTrack-CMV/HNRAGEを構築しました。シーケンス後、それはPME Iで線形化され、相同組換えを達成するためにエレクトロポレーションによりアデノウイルスゲノムプラスミドパデイシー-1を使用して、e.coli BJ5183細胞にcotransformedされました。PAC Iで消化した後、同定された組換えプラスミドのDNAをリン酸カルシウムトランスフェクションによりQBI-293A細胞にトランスフェクトして、アデノウイルスを包装しました。PadTrack-CMVでのGFP遺伝子発現の使用により、Ad-Hnrageの出現が観察され、その濃度が測定されました。標的遺伝子の発現はウエスタンブロットによって検出され、293細胞の細胞周期に対するその効果はMTT比色測定とFCMによって調べられました。 結果：AD-HNRAGEが正常に構築され、293細胞におけるHNRAGE遺伝子の発現がウエスタンブロットによって証明されました。ウイルス粒子を採取した後、AD-HNrageの濃度は約6.5x10（9）AD/Microlでした。Ad-HNrageのトランスフェクションは、トランスフェクトされていない細胞と比較して293細胞の増殖率が大幅に低く、G0-G1およびG2-M相の細胞数が増加し、S相の減少が得られました。 結論：HNRAGE遺伝子は、293細胞の成長を阻害する可能性があります。

AIM: To construct the recombinant adenovirus vector of hNRAGE gene and study its effect on the cell cycle of 293 cells. METHODS: hNRAGE gene was amplified by PCR and subcloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV to construct a shuttle plasmid pAdTrack-CMV/hNRAGE. After sequencing, it was linearized with Pme I and cotransformed into E.coli BJ5183 cells with adenovirus genomic plasmid pAdEasy-1 by electroporation to achieve homologous recombination. After being digested with Pac I, the DNA of identified recombinant plasmid was transfected into QBI-293A cells by calcium phosphate transfection to package adenovirus. With the use of GFP gene expression in pAdTrack-CMV, the appearance of Ad-hNRAGE was observed and its concentration was measured. The expression of the target gene was detected by Western blot and its effect on cell cycle of 293 cells was examined by MTT colorimetry and FCM. RESULTS: The Ad-hNRAGE was successfully constructed and the expression of hNRAGE gene in 293 cells was proved by Western blot. After harvesting the virus particles, the concentration of Ad-hNRAGE was about 6.5x10(9) Ad/microL. The transfection of Ad-hNRAGE resulted in significantly lower proliferative rate of 293 cells compared with untransfected ones, with cell number of G0-G1 and G2-M phase increasing and that of S phase decreasing. CONCLUSION: hNRAGE gene can inhibit the growth of 293 cells.