異常なスプライシングに対するMLH1およびMSH2ミスセンスおよびサイレント変異の効果のための系統的mRNA分析

遺伝性非ポリポーシス結腸癌症候群（HNPCC）ファミリーにおけるMLH1およびMSH2遺伝子変異のかなりの割合は、コード配列（ミスセンスまたはサイレント変異）内またはイントロン内のヌクレオチド置換によって特徴付けられます。これらの変異がミスマッチDNA修復タンパク質をコードする正常な機能に影響し、したがって癌の素因につながるかどうかの問題は、遺伝子検査における決定因子です。最近の研究では、いくつかのヌクレオチド置換がエクソンエンハンサー（ESE）などのシス転写要素を破壊することにより異常なスプライシングを誘導できることが示唆されています。ESEの混乱は、HNPCCファミリーで特定された推定病理学的ミスセンス変異の根底にあるメカニズムであることが提案されています。ヌクレオチド置換に起因する異常なスプライシングの有病率と、予測されるESEとの関連性を調査するために、MLH1またはMSH2遺伝子の無関係なエクソニックまたはイントニック変異を運んだ一連の60人の患者の系統的RNAスクリーニングを実施しました。異常なスプライシングは15症例で見つかりましたが、そのうち5つはエクソン変異に関連していました。計算ツールESEFINDERSとRESCUE-ESEを使用して、それらのスプライシング変異と予測される推定ESEとの間のリンクを評価しました。私たちの研究は、アルゴリズムベースのESE予測をRNAスクリーニングからの実験的観察と間違いなく相関させることはできないことを示しています。ミニゲン構築物とin vitro転写アッセイを使用することにより、ヌクレオチド置換がスプライシング欠陥の直接的な原因であることを実証しました。これは、HNPCC患者のスプライシングに対するミスセンスとサイレント変異の効果のための最初の系統的スクリーニングです。この研究で特定された病原性スプライシング変異は、遺伝カウンセリングにおける「分類されていないバリアント」の評価に寄与します。また、我々の結果は、ESE予測アルゴリズムを使用してミスセンスまたはサイレント変異の病原性効果を決定する際には注意を払わなければならないことを示唆しています。したがって、RNAレベルでの分析が必要です。

A substantial proportion of MLH1 and MSH2 gene mutations in hereditary nonpolyposis colon cancer syndrome (HNPCC) families are characterized by nucleotide substitutions, either within the coding sequence (missense or silent mutations) or in introns. The question of whether these mutations affect the normal function of encoding mismatch DNA repair proteins and thus lead to the predisposition to cancer is determinant in genetic testing. Recent studies have suggested that some nucleotide substitutions can induce aberrant splicing by disrupting cis-transcription elements such as exonic enhancers (ESEs). ESE disruption has been proposed to be the mechanism that underlies the presumed pathological missense mutations identified in HNPCC families. To investigate the prevalence of aberrant splicing resulting from nucleotide substitutions, and its relevance to predicted ESEs, we conducted a systematic RNA screening of a series of 60 patients who carried unrelated exonic or intronic mutations in MLH1 or MSH2 genes. Aberrant splicing was found in 15 cases, five of which were associated with exonic mutations. We evaluated the link between those splicing mutations and predicted putative ESEs by using the computational tools ESEfinder and RESCUE-ESE. Our study shows that the algorithm-based ESE prediction cannot be definitely correlated to experimental observations from RNA screening. By using minigene constructs and in vitro transcription assay, we demonstrated that nucleotide substitutions are the direct cause of the splicing defect. This is the first systematic screening for the effect of missense and silent mutations on splicing in HNPCC patients. The pathogenic splicing mutations identified in this study will contribute to the assessment of "unclassified variants" in genetic counseling. Our results also suggest that one must use caution when determining the pathogenic effect of a missense or silent mutation using ESE prediction algorithms. Analysis at the RNA level is therefore necessary.