微小管はオートファゴソームの形成を促進し、オートファゴソームとエンドソームの融合を促進します

真核細胞の栄養素の剥奪は、オートファジーを含むさまざまなストレス反応を引き起こします。オートファジーは、プロテアーゼ含有エンドソームとの融合後の分解のために細胞質成分とオルガネラを隔離するオートファゴソームによって行われます。オートファジーにおける微小管の役割を決定するために、ノコダゾールとビンブラスチンを使用して微小管を破壊し、原発性ラット肝細胞におけるオートファグソソームの形成と融合を独立して測定しました。オートファゴソームマーカーであるGFP-LC3のオートファゴソームへの転座とGFP-LC3の脂質を測定することにより、オートファゴソーム形成の速度と大きさを定量化しました。飢ationは、基底レベルにわたるオートファゴソーム形成の速度と、細胞あたりのオートファゴソームの総数の両方を増加させました。最大オートファゴソーム形成には、無傷の微小管ネットワークが必要でした。プロテアーゼ阻害剤の感受性の獲得によってアッセイされ、ライソスタッカーの赤陽性エンドソームとオーバーラップすることにより、オートファゴソームとエンドソームの融合は、無傷の微小管を必要としました。ライブセルイメージングは、オートファゴソームが運動性構造であり、その動きにも微小管が必要であることを実証しました。興味深いことに、ビンブラスチンは、微小管ネットワークの識別可能な変化が観察される前に、2倍以上のオートファゴソームの形成を刺激しました。ビンブラスチンによるオートファゴソーム形成の刺激は、栄養素とmTOR活性とは無関係でしたが、オートファジーに必要であることが知られているオートファジータンパク質ATG5およびATG6の枯渇により阻害されました。

Nutrient deprivation of eukaryotic cells provokes a variety of stress responses, including autophagy. Autophagy is carried out by autophagosomes which sequester cytosolic components and organelles for degradation after fusion with protease-containing endosomes. To determine the role of microtubules in autophagy, we used nocodazole and vinblastine to disrupt microtubules and independently measured formation and fusion of autophagsosomes in primary rat hepatocytes. By measuring the translocation of GFP-LC3, an autophagosomal marker, to autophagosomes and the lipidation of GFP-LC3, we quantified the rate and magnitude of autophagosome formation. Starvation increased both the rate of autophagosome formation over the basal level and the total number of autophagosomes per cell. Maximal autophagosome formation required an intact microtubule network. Fusion of autophagosomes with endosomes, assayed by acquisition of protease-inhibitor sensitivity as well as overlap with LysoTracker Red-positive endosomes, required intact microtubules. Live-cell imaging demonstrated that autophagosomes were motile structures, and their movement also required microtubules. Interestingly, vinblastine stimulated autophagosome formation more than twofold before any discernable change in the microtubule network was observed. Stimulation of autophagosome formation by vinblastine was independent of nutrients and mTOR activity but was inhibited by depletion of the Autophagy proteins Atg5 and Atg6, known to be required for autophagy.