Loxosceles intermedia spider venomからのスフィンゴミエリナーゼDの速度論的および機械的特性評価

Loxosceles属のArachnidsによる啓発は、主にスフィンゴミエリナーゼDによって誘発される局所的な皮膚侵害と深刻な全身毒性につながります（Smase D）。これらの酵素は、スフィンゴミエリンの加水分解を触媒し、セラミド - リン酸とコリンの形成を引き起こし、脂質メディエーターリソホスファチジ酸を生成するリゾホスファチジルコリンの切断を触媒します。以前は、Loxosceles intermedia venomと比較タンパク質シーケンス分析のP1とP2という名前の2つの機能的SMase Dアイソフォームをクローン化および発現させました。8バレル。これらのタンパク質をさらに特徴付けるために、2つの活性SMase DアイソフォームのpH依存性運動実験と化学修飾を実施しました。ここでは、触媒と金属イオン結合部位に関与するアミノ酸が、L。intermediaのSmase Dアイソフォームで厳密に保存されていることを示しています。しかし、動力学的研究は、SMase P1がP2よりも効率的にスフィンゴミエリンを加水分解することを示しています。これは、おそらく副節認識で役割を果たす可能性のある疎水性チャネルの位置203（Pro-Leu）および局所アミノ酸置換に起因する可能性があります。とバインディング。

Envenomation by arachnids of the genus Loxosceles leads to local dermonecrosis and serious systemic toxicity mainly induced by sphingomyelinases D (SMase D). These enzymes catalyze the hydrolysis of sphingomyelin resulting in the formation of ceramide-phosphate and choline as well as the cleavage of lysophosphatidyl choline generating the lipid mediator lysophosphatidic acid. We have, previously, cloned and expressed two functional SMase D isoforms, named P1 and P2, from Loxosceles intermedia venom and comparative protein sequence analysis revealed that they are highly homologous to SMase I from Loxosceles laeta which folds to form an (alpha/beta)8 barrel. In order to further characterize these proteins, pH dependence kinetic experiments and chemical modification of the two active SMases D isoforms were performed. We show here that the amino acids involved in catalysis and in the metal ion binding sites are strictly conserved in the SMase D isoforms from L. intermedia. However, the kinetic studies indicate that SMase P1 hydrolyzes sphingomyelin less efficiently than P2, which can be attributed to a substitution at position 203 (Pro-Leu) and local amino acid substitutions in the hydrophobic channel that could probably play a role in the substrate recognition and binding.