タンパク質化学におけるアプリケーションのために人為的に分割されたinteins：スプリットSSP DNABインテインの生化学的特性評価と分割SCE VMAインテインとの比較

タンパク質トランススプライシングでは、インテインドメインが2つのポリペプチド鎖に分割され、隣接するアミノ酸配列、NおよびC末端のエクステインとネイティブペプチド結合の連鎖が媒介されます。このプロセスは、たとえば、NMR研究の同位体とのセグメント標識または化学および生物物理学的プローブの組み込みのために、2つの個別に調製されたフラグメントからタンパク質を組み立てるために活用できます。スプリットインテインは、遺伝的手段によって人為的に生成できます。ただし、精製されたインテインとInteincの断片は通常、活性インテインに折りたたむために変性と再飽和処理を必要とするため、改良できないタンパク質への適用を妨げます。ここでは、Synechocystis sppの人為的に分割されたDNabヘリカーゼの精製された断片が報告されています。PCC6803（SSP DNAB）インテインは、ネイティブ条件下でアクティブです。タンパク質トランススプライシング反応の1次速度定数は7.1 x 10（-4）s（-1）でした。Saccharomyces cerevisiae（SCE VMA）インテインの前述の分割液胞ATPaseは、ネイティブ条件下で活性である他の人為的に分割された唯一のインテインです。ただし、効率的なタンパク質トランススプライシングのために、補助二量体化ドメインによってインテインフラグメントの誘導型複合体形成が必要です。対照的に、二量体化ドメインの分割SSP DNABインテインフラグメントへの融合は、活動に影響を与えませんでした。この違いは、スプリットSSP DNABインテインの熱安定性が高いことによっても反映されていました。最適化された条件下での分割SCE VMAインテインのさらなる調査により、タンパク質トランススプライシングの場合は9.4 x 10（-4）s（-4）s（-4）s（-3）s（-3）s（-1）の1次速度定数が明らかになりました。Cys1ala変異体を含むC末端切断。最後に、2つの分割された整数が直交していることを示し、2つ以上の部分からのタンパク質のアセンブリにさらなる用途を示唆しています。

In protein trans-splicing, an intein domain split into two polypeptide chains mediates linkage of the flanking amino acid sequences, the N- and C-terminal exteins, with a native peptide bond. This process can be exploited to assemble proteins from two separately prepared fragments, e.g., for the segmental labeling with isotopes for NMR studies or the incorporation of chemical and biophysical probes. Split inteins can be artificially generated by genetic means; however, the purified inteinN and inteinC fragments usually require a denaturation and renaturation treatment to fold into the active intein, thus preventing their application to proteins that cannot be refolded. Here, we report that the purified fragments of the artificially split DnaB helicase of Synechocystis spp. PCC6803 (Ssp DnaB) intein are active under native conditions. The first-order rate constant of the protein trans-splicing reaction was 7.1 x 10(-4) s(-1). The previously described split vacuolar ATPase of Saccharomyces cerevisiae (Sce VMA) intein is the only other artificially split intein that is active under native conditions; however, it requires induced complex formation of the intein fragments by auxiliary dimerization domains for efficient protein trans-splicing. In contrast, fusion of the dimerization domains to the split Ssp DnaB intein fragments had no effect on activity. This difference was also reflected by a higher thermostability of the split Ssp DnaB intein. Further investigations of the split Sce VMA intein under optimized conditions revealed a first-order rate constant of 9.4 x 10(-4) s(-1) for protein trans-splicing and 1.7 x 10(-3) s(-1) for C-terminal cleavage involving a Cys1Ala mutant. Finally, we show that the two split inteins are orthogonal, suggesting further applications for the assembly of proteins from more than two parts.