T4バクテリオファージ遺伝子32タンパク質を使用したin vitro転写と全長cDNA合成の最適化

in vitro転写と逆転写に対するT4バクテリオファージ遺伝子32タンパク質（T4GP32）の効果を評価しました。T4GP32は、T7 RNAポリメラーゼで得られたin vitro転写産物の収率を2倍にし、RNASEH欠損モロニーマウス白血病ウイルス[AU：OK]逆転写酵素と組み合わせて使用するとcDNA合成の収率を増加させました。プラスの効果は、T4GP32のRNAシャペロン活性と相関する可能性があります。T4GP32は、特に7 kBを超える長いcDNAの合成を刺激しました。比較すると、トレハロースによる逆転写酵素の熱活性化は、より短いcDNAの産生を増やすだけでした。平均cDNAサイズが1.2 kbpであるシロイヌナズナのcDNAライブラリーの構築のために、標準反応条件下でのT4GP32の存在と熱活性化の両方で、同様に高い割合のフルレングスcDNAをもたらしました。ただし、標準の逆転写反応にT4GP32を含めると、cDNA収量が最も高くなりました。標準の逆転写反応にT4GP32を添加すると、フルレングスcDNAライブラリーの品質と収量が増加する可能性があると結論付けています。

We evaluated the effect of the T4 bacteriophage gene 32 protein (T4gp32) on in vitro transcription and reverse transcription. T4gp32 doubled the yield of in vitro transcripts obtained with T7 RNA polymerase and increased the yield of cDNA synthesis when used in combination with an RNaseH-deficient Moloney murine leukemia virus [Au: ok] reverse transcriptase. The positive effect could be correlated with the RNA chaperone activity of T4gp32. T4gp32 stimulated the synthesis of long cDNAs, particularly species longer than 7 kb. By comparison, thermal activation of reverse transcriptase with trehalose only boosted the production of shorter cDNAs. For the construction of an Arabidopsis thaliana cDNA library, where the average cDNA size is 1.2 kbp, both the presence of T4gp32 under standard reaction conditions as well as thermal activation resulted in similarly high percentages of full-length cDNA. However, the inclusion of T4gp32 in a standard reverse transcription reaction resulted in the highest cDNA yield. We conclude that the addition of T4gp32 in standard reverse transcription reactions can increase the quality and yield of full-length cDNA libraries.