ベータラクトグロブリンの天然構造とその応用に特異的な新しい立体構造依存性モノクローナル抗体

溶融球体は、タンパク質の折り畳みと展開の一般的な中間体であると考えられています。ベータラクトグロブリン（ベータLG）は、総乳タンパク質の約10〜15％を構成する主要なウシホエイタンパク質の1つです。最近、熱加工牛乳を評価するための優れたマーカーとしてBeta-LGを特定しました。ベータLGの鎖は、熱変性ベータLGに特異的なモノクローナル抗体（mAb）によってプローブされた不可逆的な熱展開に関与します。本研究では、ネイティブベータ-LGを免疫原として使用して、ネイティブベータLGに対する特定のMABが確立できるという仮説をテストしました。その結果、ベータLGのネイティブ構造に対応したmAb（4H11E8）が作成されました。抗体は、その二量体や凝集体など、ベータLGの熱変性型を認識していませんでした。この「ネイティブ」MABを使用したイムノアッセイは、ベータLGの安定性が温度<70度であることを示しました。変性は、ベータLGの遷移温度と相関していた。ベータLGのCys（カルボキシメチル化）または正に帯電した残基（アセチル化）のさらなる化学修飾は、その免疫反応性を完全に廃止し、このMABの立体構造依存性の性質を確認しました。競争力のあるELISAを使用して、4H11E8 MABは、商業的に加工された牛乳のネイティブベータLG含有量を決定できます。ネイティブベータLGの濃度は、テストされたローカルブランドの間で大きく異なりました。技術的な観点から、この研究で作成されたMABは、牛乳や他の乳製品の熱衛生用の適切なプロセスの設計と運用に関連しています。

Molten globules are thought to be general intermediates in protein folding and unfolding. beta-lactoglobulin (beta-LG) is one of the major bovine whey proteins, constituting approximately 10 to 15% of total milk proteins. We have recently identified beta-LG as a superior marker for evaluating thermally processed milk. Strand D of beta-LG participates in irreversible thermal unfolding as probed by a monoclonal antibody (mAb) specific to thermally denatured beta-LG. In the present study, we used native beta-LG as an immunogen to test the hypothesis that a specific mAb against the native beta-LG could be established. As result, a mAb (4H11E8) directed against the native structure of beta-LG was made. The antibody did not recognize the heat-denatured form of beta-LG, such as its dimer and aggregates. Immunoassay using this "native" mAb showed that the stability of beta-LG was at temperatures < or =70 degrees C. beta-Lactoglobulin began to deteriorate between 70 and 80 degrees C over time. The denaturation was correlated with the transition temperature of beta-LG. Further chemical modification of Cys (carboxymethylation) or positively charged residues (acetylation) of beta-LG totally abolished its immunoreactivity, confirming the conformation-dependent nature of this mAb. Using competitive ELISA, the 4H11E8 mAb could determine the native beta-LG content in commercially processed milks. Concentrations of native beta-LG varied significantly among the local brands tested. From a technological standpoint, the mAb prepared in this study is relevant to the design and operation of appropriate processes for thermal sanitation of milk and of other dairy products.