ヒトDNAポリメラーゼデルタの第4サブユニットであるP12の機能的役割

染色体DNA複製の重要な酵素である哺乳類DNAポリメラーゼデルタ（Pol Delta）は、次のように4つのサブユニットで構成されています。触媒サブユニット。P125は、P50サブユニットにしっかりと関連付けられています。P68、増殖細胞核抗原（PCNA）結合タンパク質。4番目のサブユニット、P12。この研究では、Pol DeltaのP12サブユニットの機能的役割を研究しました。P12サブユニットのサブユニット間相互作用は、酵母2ハイブリッドアッセイとプルダウンアッセイによって決定されました。これらのアッセイは、P12がP125およびP50と相互作用することを明らかにしました。P12のこの二重相互作用は、P125-P50相互作用を安定させるのに役立つ可能性があることを示唆しています。P12は、新規PCNA結合タンパク質であることが示されました。これは、結合アッセイによるN末端でのPCNA結合モチーフの識別と部位指向の突然変異誘発によって確認されました。PCNA結合に欠陥があるP12変異体を含む組換えPol Deltaの活性と反応産物、および精製された組換えPol Deltaとそのサブアセンブリを分析しました。我々の結果は、P12がPCNA依存性Pol Delta活性に寄与していること、つまりP12-PCNA相互作用が機能していることを示しています。私たちのデータは、最適なPol Delta活性にP12とP68の両方が必要であることを示しています。これは、Pol DeltaとPCNAの間の相互作用がP12とP68を含むDivalentの相互作用であるという仮説を支持しています。Pol DeltaがPCNAと少なくとも2つのサブユニットを介して相互作用するモデルと、P12がPol Delta-PCNA複合体全体とPol Delta自体の安定化に役割を果たすことができるモデルを提案します。

Mammalian DNA polymerase delta (pol delta), a key enzyme of chromosomal DNA replication, consists of four subunits as follows: the catalytic subunit; p125, which is tightly associated with the p50 subunit; p68, a proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-binding protein; and a fourth subunit, p12. In this study, the functional roles of the p12 subunit of pol delta were studied. The inter-subunit interactions of the p12 subunit were determined by yeast two-hybrid assays and by pulldown assays. These assays revealed that p12 interacts with p125 as well as p50. This dual interaction of p12 suggests that it may serve to stabilize the p125-p50 interaction. p12 was shown to be a novel PCNA-binding protein. This was confirmed by identification of a PCNA-binding motif at its N terminus by binding assays and by site-directed mutagenesis. The activities and reaction products of recombinant pol delta containing a p12 mutant defective in PCNA binding, as well as purified recombinant pol delta and its subassemblies, were analyzed. Our results indicate that p12 contributes to PCNA-dependent pol delta activity, i.e. the p12-PCNA interaction is functional. Our data indicate that both p12 and p68 are required for optimal pol delta activity. This supports the hypothesis that the interaction between pol delta and PCNA is a divalent one that involves p12 and p68. We propose a model in which pol delta interacts with PCNA via at least two of its subunits, and one in which p12 could play a role in stabilizing the overall pol delta-PCNA complex as well as pol delta itself.