2次元マップを介したプロテオーム分析における実際のおよび架空のアーティファクト

現在のレビューでは、分離技術（この場合は2次元マッピング）自体によって誘導される可能性のあるアーティファクト（つまり、分析中の生物学的サンプルに属さないスプリアススポットの生成）に関する長期にわたる議論に触れています。ここでは、過去に常に非難されている最大の犯罪者のいくつか（少なくとも1970年以来、つまり、ゲルベースの等電位焦点焦点プロトコルの開始以来）、すなわち、分離（ASNおよびGLN残基の）およびカルバミル化（尿素溶液で生成されたシアン酸塩による）は、単に実証されていない場合を除いて、単に実証されていないことが示されています。逆に、2つの予期しない主要なアーティファクトが最近、2Dマッピングを悩ませることが示されています。1つは、電界に入る前にアルキル化されていないサンプルにおけるホモおよびヘテロオリゴマーの形成です。この現象は、アルカリ性pH領域で非常に悪化しており、元のサンプルには存在しない印象的な数の偽のスポットにつながる可能性があります。したがって、アルキル化（アクリルアミドまたはビニルピリジンで行う場合は最適）は、そのような偽の斑点を避け、アルカリ性ゲル領域でのサンプルの縞模様と塗抹を維持し、サンプルの完全性を維持するために必須です。実際、他の予期しないアーティファクトは脱硫（ベータエリミネーション）であり、それによって、長時間の電気泳動により、サンプルは残基から-SHグループを緩めます。この損失は、長期的には、ポリペプチド鎖に沿ったC-N結合の溶解による大規模なタンパク質分解を伴います。ここでも、Cysの-SHグループのアルキル化は、この有害な分解現象をほぼ完全に防ぎます。

The present review touches on a long-lasting debate on possible artefacts (i.e. generation of spurious spots, not belonging to the biological sample under analysis) induced by the separation technique (in this case, two-dimensional mapping) per se. It is shown here that some of the biggest offenders, always blamed in the past (at least since 1970, i.e. since the inception of gel-base isoelectric focusing protocols), namely deamidation (of Asn and Gln residues) and carbamylation (due to cyanate produced in urea solution), simply do not occur in properly handled samples and have never indeed been demonstrated in real samples, except when forced in purpose. Conversely, two unexpected major artefacts have been recently shown to plague 2D mapping. One is formation of homo- and hetero-oligomers in samples that have been reduced but not alkylated prior to entering the electric field. The phenomenon is highly aggravated in alkaline pH regions and can lead to an impressive number of spurious spots not existing in the original sample. Thus, alkylation (best if performed with acrylamide or vinylpyridines) is a must for avoiding such spurious spots, as well as sample streaking and smearing in the alkaline gel region, and for maintaining sample integrity. In fact, the other unexpected artefact is desulfuration (beta-elimination) by which, upon prolonged electrophoresis, the sample looses an -SH group fro Cys residues. This loss, in the long run, is accompanied by massive protein degradation due to lysis of a C-N bond along the polypeptide chain. Here too, alkylation of -SH groups of Cys almost completely prevents this noxious degradation phenomenon.