Fプラスミド移動領域遺伝子、TRBA、ARTA、TRAQ、およびTRBBに挿入変異を運ぶ誘導体の構造と特性評価

以前に特徴付けられていない遺伝子座に関連する機能を調査する手段として、FプラスミドTRA領域遺伝子の挿入変異を構築する方法を考案しました。最初に、小さなキメラプラスミドによって運ばれるTRA領域フラグメント内の独自の制限部位にカナマイシン耐性遺伝子を挿入することにより、in vitroで突然変異を構築しました。第二に、完全なf TRA領域配列（F LAC、またはPOX38、TRA+ Fプラスミド誘導体のいずれか）を含むプラスミドに、in vivoで挿入変異を交差させました。この方法を使用して、TRAQにKMR遺伝子挿入を運ぶF LAC変異誘導体を取得し、TRBA、ARTA、TRAQ、またはTRBBにKMR遺伝子挿入を運ぶPOX38変異誘導体のセットを取得しました。これらの誘導体の分析により、TRAQのNSII部位にKan遺伝子を挿入すると、移動不足、F-Pilus特異的視野耐性、検出可能なF-Pilinサブユニット合成がないことが示されました。TRAQ変異体は、TRAQ+プラスミドクローンで補完すると野生型の表現型を取り戻したため、TRAQの発現は転写およびF-Pilus合成に不可欠であると結論付けました。ただし、遺伝子TRBA、ARTA、またはTRBBにKAN遺伝子インサートを運ぶPOX38誘導体は、F-Pilus特異的ファージ感受性を保持し、正常レベルで転写しました。したがって、これらの3つの遺伝子産物は、標準的な交尾条件下での大腸菌K-12からのF-Transferには不可欠ではないかもしれません。

We devised a method for construction of insertion mutations in F plasmid tra region genes as a means of investigating the functions associated with previously uncharacterized loci. First, we constructed mutations in vitro, by insertion of a kanamycin resistance gene into a unique restriction site within a tra region fragment carried by a small, chimeric plasmid. Second, we crossed the insertion mutations, in vivo, onto a plasmid containing the complete F tra region sequence (either F lac, or pOX38, a Tra+ F plasmid derivative). Using this method, we obtained F lac mutant derivatives carrying KmR gene insertions in traQ, and a set of pOX38 mutant derivatives carrying a KmR gene insertion in trbA, artA, traQ, or trbB. Analysis of these derivatives showed that insertion of a kan gene at the NsiI site of traQ resulted in transfer deficiency, F-pilus-specific-phage resistance and an absence of detectable F-pilin subunit synthesis. Since the traQ mutants regained a wild-type phenotype when complemented with a traQ+ plasmid clone, we concluded that traQ expression is essential to transfer and F-pilus synthesis. However, pOX38 derivatives carrying kan gene inserts in genes trbA, artA, or trbB retained F-pilus-specific phage sensitivity and transferred at normal levels. Thus, these three gene products may not be essential for F-transfer from Escherichia coli K-12 under standard mating conditions.