タバコモザイクウイルスの完全なゲノムのcDNAクローニングと感染性転写産物の産生

タバコモザイクウイルス（TMV）のゲノム全体が一連のサブジェノムcDNAクローンにコピーされました。TMVの5 'および3'末端のcDNA配列を個別にクローニングしました。合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、5 '末端でPST Iサイトを生成しましたが、3'末端でNDE Iサイトを生成するために別のプライマーを使用しました。この戦略により、制限エンドヌクレアーゼ切断後のエキソヌクレアーゼVIIによる治療により、クローン化されたcDNAインサートから非TMV配列を除去することができました。PST Iリンカーは、TMV 3 '端子cDNAに追加されました。サブ遺伝子cDNAフラグメントは、TMV cDNA配列をPST I消化により単一のフラグメントとしてきれいに切除できるいくつかの独立したフル遺伝子構造に結び付けられました。全遺伝子TMV cDNAをPPM1からラムダファージプロモーターからすぐに下流に連結し、大腸菌RNAポリメラーゼとin vitroで転写しました。3 '末端に6つの非TMVヌクレオチドが含まれていたにもかかわらず、4つのフルゲノミックcDNA構造のうち3つからのRNA転写産物は感染性でした。5 '末端に6個の余分なヌクレオチドを備えた構造からの転写も感染性がありました。cDNA転写産物に感染した植物からの子孫ウイルスは、親ウイルスと同じように見えました。ゲノムの同じ領域の独立したcDNAクローンの制限マップは、互いに同一であり、TMVの報告されたヌクレオチド配列から予測されたとおりでした。また、4つの独立したcDNAクローンの5 '末端に近い200ヌクレオチドの配列は、互いに同一であり、公開された配列と同一であり、TMVの独立した分離株が非常に類似した配列を持っている可能性があることを示唆しています。

The entire genome of tobacco mosaic virus (TMV) was copied into a series of subgenomic cDNA clones. cDNA sequences of the 5' and 3' ends of TMV were cloned separately. A synthetic oligonucleotide primer was used to generate a Pst I site at the 5' terminus, whereas a different primer was used to generate an Nde I site at the 3' terminus. This strategy permitted removal of non-TMV sequences from cloned cDNA inserts by treatment with exonuclease VII following restriction endonuclease cleavage. Pst I linkers were added to TMV 3' terminal cDNAs. Subgenomic cDNA fragments were ligated together into several independent full-genomic constructions from which TMV cDNA sequences could be cleanly excised as a single fragment by Pst I digestion. Full-genomic TMV cDNA was ligated immediately downstream from the lambda phage promoter from pPM1 and transcribed in vitro with Escherichia coli RNA polymerase. RNA transcripts from three of four full-genomic cDNA constructions were infectious, even though they contained 6 non-TMV nucleotides at the 3' end. Transcripts from a construction with 6 extra nucleotides at the 5' end also were infectious. Progeny virus from plants infected with cDNA transcripts appeared identical to the parental virus. Restriction maps of independent cDNA clones of the same regions of the genome were identical to each other and as predicted from the reported nucleotide sequence of TMV. Also, sequences of the 200 nucleotides proximal to the 5' termini of four independent cDNA clones were identical to each other and to published sequences, suggesting that independent isolates of TMV may have remarkably similar sequences.