構造研究のための組換えThermus acquaticus RNAポリメラーゼ

細菌転写の構造生物学の進歩は、熱性強力性Thermus aquaticus（Taq）およびThermus Thermophilus（TTH）からのRNAポリメラーゼ（RNAP）の研究から得られています。これらの構造研究は、大量のTAQまたはTTH細胞貼り付けから積極的に精製され、遺伝子修飾のためのオプションがほとんど提供されていない内因性TAQまたはTTH RNAPのみが構造研究に適しているという事実によって制限されています。異種宿主である大腸菌における共存とアセンブリによるTAQ RNAPの調製のための組換えシステムが報告されていますが、これらは結晶学的研究に適した酵素を生成しませんでした。ここでは、TAQベータ '非保存ドメイン（NCD）の完全または部分的な欠失を抱えるTAQ RNAPの調製のための組換えシステムについて説明し、結晶学的研究に適した酵素を生成します。これにより、遺伝的に操作された酵素の構造研究が開かれ、より結晶化可能な酵素の調製が可能になり、詳細な構造/機能分析が促進されます。この研究で生成されたtaqbeta'ncd削除変異体の特性評価は、ベータncdがSigmaサブユニットの効率的な結合に重要であることを示し、以前の仮説を確認しました。最後に、組換え変異体の1つの予備構造解析（4.1Angstroms解像度）により、以前に観察されていなかったベータフラップの立体構造が明らかになり、この柔軟な構造要素にアクセス可能な立体構造の範囲がさらに定義されました。

Advances in the structural biology of bacterial transcription have come from studies of RNA polymerases (RNAPs) from the thermophilic eubacteria Thermus aquaticus (Taq) and Thermus thermophilus (Tth). These structural studies have been limited by the fact that only endogenous Taq or Tth RNAP, laboriously purified from large quantities of Taq or Tth cell paste and offering few options for genetic modification, is suitable for structural studies. Recombinant systems for the preparation of Taq RNAP by co-overexpression and assembly in the heterologous host, Escherichia coli, have been described, but these did not yield enzyme suitable for crystallographic studies. Here we describe recombinant systems for the preparation of Taq RNAP harboring full or partial deletions of the Taq beta' non-conserved domain (NCD), yielding enzyme suitable for crystallographic studies. This opens the way for structural studies of genetically manipulated enzymes, allowing the preparation of more crystallizable enzymes and facilitating detailed structure/function analysis. Characterization of the Taqbeta'NCD deletion mutants generated in this study showed that the beta'NCD is important for the efficient binding of the sigma subunit, confirming previous hypotheses. Finally, preliminary structural analysis (at 4.1Angstroms resolution) of one of the recombinant mutants revealed a previously unobserved conformation of the beta-flap, further defining the range of conformations accessible to this flexible structural element.