PCRベースのマイコプラズマ検出アッセイの検証概念の導入

背景：マイコプラズマ汚染は、細胞培養に関連する最も頻繁に発生する問題の1つです。細胞株と治療薬のマイコプラズマ検査の法的要件（ヨーロッパの薬局方とFDA）を満たすために、マイコプラズムを検出し、検証概念を導入するためのPCRベースの方法を開発しました。 方法：PCRアッセイは、16S RDNAをコードする遺伝子の280 bp DNAフラグメントを特異的に増幅します。プライマー結合部位を含む人工オリゴヌクレオチドの同時増幅により、PCRの有効性の制御が可能になりました。PCRアッセイの検証は、2つのマイコプラズマ参照株、M。OraleとM. Pneumoniaeを使用して実行されました。検証概念には、（i）細菌代謝の指標を伴う培地におけるM. oraleおよびM. pneumoniaeの栽培、（ii）繰り返し希釈実験における色変化ユニット（CCU）の決定、および（iii）PCRの相関関係が含まれます。CCU値の結果。 結果：検出範囲には、細胞培養で最も一般的に見られるすべてのマイコプラズマ種が含まれることがわかりました。PCRの分析感度は、M。roraleおよびM. pneumoniaeのCCU相当100に相当しました。プロビット分析により、M。pneumoniaeの場合は1222（935-1844）CCU/mlの平均濃度で9％の検出確率が明らかになりました。 議論：マイコプラズマ検出アッセイの検証は、細胞培養のマイコプラズマ汚染の重要な問題の管理に役立つ魅力的な診断ツールとしてPCRをサポートしました。

BACKGROUND: Mycoplasma contamination is amongst the most frequently occurring problems associated with cell cultures. In order to meet the legal requirements (European Pharmacopoeia and FDA) for Mycoplasma testing of cell lines and therapeutics, we have developed a PCR-based method to detect mycoplasms and introduce a validation concept. METHODS: The PCR assay specifically amplifies a 280-bp DNA fragment of the gene coding for the 16S rDNA. Simultaneous amplification of an artificial oligonucleotide containing primer-binding sites allowed control of the efficacy of the PCR. The validation of the PCR assay was performed with two Mycoplasma reference strains, M. orale and M. pneumoniae. The validation concept included (i) cultivation of M. orale and M. pneumoniae in medium with an indicator for bacterial metabolism, (ii) determination of the color-changing units (CCU) in repeated dilution experiments and (iii) correlation of the PCR results with CCU values. RESULTS: The detection range was found to include all Mycoplasma species most commonly found in cell cultures. The analytical sensitivity of the PCR was the CCU equivalent of 100 for M. orale and M. pneumoniae. Probit analysis revealed a detection probability of 9% for a mean concentration of 1222 (935-1844) CCU/mL for M. pneumoniae and 2547 (1584-10,352) CCU/mL for M. orale. DISCUSSION: The validation of the Mycoplasma detection assay supported PCR as an attractive diagnostic tool that will help manage the important issue of Mycoplasma contamination of cell cultures.