培養ウシ卵胞細胞におけるシングルチェーンウシLHアナログのステロイド酸化効果

単一鎖のゴナドトロピン類似体は、構造機能研究とアナログ設計を目的として構築されていました。ヒト生殖腺ロピンのテザー付きサブユニットドメインの間に絨毛膜ドトロピン（CG）ベータサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（CTP）に由来するスペーサーの組み込みは、生物活性を混乱さない単一鎖変異体の分泌に有益です。CTPドメインを含むCGBETAサブユニットは霊長類と等量でのみ発現されますが、CTP様配列は、ウシ種を含むいくつかの哺乳類種のLHBETA遺伝子の翻訳されていない領域に存在します。ウシLhbeta DNA（「boctp」と呼ばれる）で暗号化されたCTPと、ヒトCGBETAサブユニット（「HUCTP」と表される）に由来するCTPは、ウシ単一チェーン胸膜（LH）類似体の設計におけるリンカー配列として機能しました。。本研究の目的は、これらの単一鎖類似体による刺激後の培養されたウシTHECA細胞のステロイド酸化を評価することでした。発現CHO細胞の条件付けされた培地におけるlhbetaboctpalphaおよびlhbetahuctpalphaアナログの濃度は、「リンカーレス」lhbetaalphaおよびlhbeta1111alphaバリエーションの条件付け培地よりも3〜6倍高かった。4つの類似体は、用量依存的にアンドロスチンゲンとプロゲステロン分泌を用量依存的に誘導しましたが、ステロイド酸性反応の違いが観察されました。lhbetaboctpalphaアナログ（10 ng/ml）は、刺激されていないレベルにわたってアンドロステンジオンとプロゲステロン分泌を効果的に誘導しました（それぞれアンドロステンジオンとプロゲステロンの4.0倍および4.4倍の増加）。下垂体ウシLH標準（10 ng/mL）に対する反応は、両方のステロイド（基底レベルで2〜3倍増加する）であまり顕著ではありませんでした。lhbetahuctpalpha、lhbetaalpha、およびlhbeta111alphaの活動は、lhbetaboctpalpha活性と比較して等しく減少しました。データは、lhbetaboctpalphaが最も強力なものとしてランク付けされたことを示唆しており、これは低用量（1 ng/ml）でアナログを使用した場合にさらに顕著であることが示唆されました。これらのデータは、HUCTPまたはBOCTPリンカーを含む設計が、シングルチェーンウシLHアナログの生産に有利であることを示唆しています。さらに、ウシLhbeta遺伝子に由来する謎めいたBOCTPシーケンスを使用したテザーサブユニットドメインの間隔は、種固有のバイオアッセイでステロイド産生を刺激する目的で有利に見えます。したがって、非rimiTim、非均等種で生物活性シングルチェーンLHアナログを生成する効果的な戦略は、同じ生物のDNAに由来するスペーサーとして不可解なCTP配列を発現することを目的として、LHBETA遺伝子の変異となるでしょう。。

Single-chain gonadotropin analogs had been constructed for the purpose of structure-function studies and analog design. Incorporation of a spacer derived from the carboxyl terminal peptide (CTP) of the choriogonadotropin (CG) beta subunit between the tethered subunit domains of the human gonadotropins is beneficial for the secretion of the single-chain variants without compromising biocactivity. Although the CGbeta subunit containing the CTP domain is expressed only in primates and equids, a CTP-like sequence exists in the untranslated region of the LHbeta gene of several mammalian species, including the bovine species. The CTP encrypted in the bovine LHbeta DNA (designated as 'boCTP') and the CTP derived from the human CGbeta subunit (denoted as 'huCTP') served as a linker sequence in the design of bovine single-chain luteinizing hormone (LH) analogs. The purpose of the present study was to evaluate steroidogenesis in cultured bovine theca cells following stimulation with these single-chain analogs. The concentration of the LHbetaboCTPalpha and LHbetahuCTPalpha analogs in the conditioned media of the expressing CHO cells was three- to six-fold higher than that of the "linkerless" LHbetaalpha and LHbeta111alpha variants. The four analogs induced androstenedione and progesterone secretion from the primary theca cells in a dose-dependent manner, but differences in the steroidogenic response were observed. The LHbetaboCTPalpha analog (10 ng/ml) effectively induced androstenedione and progesterone secretion over unstimulated levels (4.0- and 4.4-fold increase for androstenedione and progesterone, respectively). The response to the pituitary bovine LH standard (10 ng/ml) was less pronounced for both steroids (two- to three-fold increase over basal levels). The activities of LHbetahuCTPalpha, LHbetaalpha and LHbeta111alpha were comparable and sightly reduced relative to the LHbetaboCTPalpha activity. The data suggested that LHbetaboCTPalpha was ranked as the most potent and this was even more prominent when analogs were used at a lower dose (1 ng/ml). These data suggest that the design, including the huCTP or boCTP linker, is favorable for the production of single-chain bovine LH analogs. Furthermore, spacing of the tethered subunit domains with the cryptic boCTP sequence that originated from the bovine LHbeta gene appears advantageous for the purpose of stimulating steroid production in the species-specific bioassay. Thus, an effective strategy to produce bioactive single-chain LH analogs in non-primate, non-equid species would be the mutatation of the LHbeta genes with the aim of expressing the cryptic CTP sequence as a spacer derived from the DNA of the same organism.