高等植物ミトコンドリアにおけるビオチンと3-メチルクロトニル - コエンザイムAカルボキシラーゼの特性評価

グリーンエンドウ（ピサムサティバム）の葉のミトコンドリアには、ペルオキシソームやクロロフィル汚染がないことを精製し、ビオチン含有量を調べました。植物ミトコンドリアで検出された結合ビオチンの大部分は、マトリックス空間に約13ミクロモルの濃度に関連することが示され、遊離ビオチンは検出されませんでした。西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使用したミトコンドリアポリペプチドのウエスタンブロット分析により、76,000の分子量を持つビオチン含有ポリペプチドが明らかになりました。このポリペプチドは、3-メチルクロトニル - コエンザイムA（COA）カルボキシラーゼのビオチン化サブユニットとして関与していました。エンドウ豆の葉プロトプラストの分別は、この酵素活性が主にミトコンドリアに位置していることを示しました。3-メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性は、等張培地でアッセイされると潜在的でした。酵素活性の大部分は、ミトコンドリアの可溶性マトリックスに見られました。Mg（2+）の存在下で、最大3-メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼ活性がpH 8.3で見つかりました。酵素基質の運動定数（見かけのK（M）値）は、3-メチルクロトニル-CoA、0.05ミリモルでした。ATP、0.16ミリモル;HCO（3）（ - ）、2.2ミリモラ。植物ミトコンドリアにおけるロイシン分解経路における3-メチルクロトニル-CoAカルボキシラーゼの関与が提案されています。

Mitochondria from green pea (Pisum sativum) leaves were purified free of peroxisomes and chlorophyll contamination and examined for their biotin content. The bulk of the bound biotin detected in plant mitochondria was shown to be associated with the matrix space to a concentration of about 13 micromolar, and no free biotin was detected. Western blot analysis of mitochondrial polypeptides using horseradish peroxidase-labeled streptavidin revealed a unique biotin-containing polypeptide with a molecular weight of 76,000. This polypeptide was implicated as being the biotinylated subunit of 3-methylcrotonyl-coenzyme A (CoA) carboxylase. Fractionation of pea leaf protoplasts demonstrated that this enzyme activity was located largely in mitochondria. The 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase activity was latent when assayed in isotonic media. The majority of the enzyme activity was found in the soluble matrix of mitochondria. Maximal 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase activity was found at pH 8.3 in the presence of Mg(2+). Kinetic constants (apparent K(m) values) for the enzyme substrates were: 3-methylcrotonyl-CoA, 0.05 millimolar; ATP, 0.16 millimolar; HCO(3) (-), 2.2 millimolar. The involvement of 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase in the leucine degradation pathway in plant mitochondria is proposed.