トランスジェニック植物細胞培養からのGFP融合タンパク質の精製

緑色蛍光タンパク質（GFP）は、ライフサイエンスの多くの分野で広く使用されているレポーターになりました。GFP融合を介した外来タンパク質発現の監視も、バイオプロセスの用途にとって非常に魅力的です。GFP自体は、いくつかの方法によって組換え生物から精製されており、多くの場合、一部のタンパク質に不安定になる可能性のある不利な条件（例えば、有機溶媒や低pHの使用）を含む。この研究では、融合の完全性を維持するために穏やかな条件下で純度と収量を最大化する目的で、タバコ懸濁液細胞で産生されるGFP融合タンパク質の単純な3段階の精製手順を伴う一般的な回復スキームを開発しました。パートナー。30％（v/v）沈殿した粒子状物質を沈殿させ、凝集した材料を除去しながら、同時にGFP溶解度を維持し、疎水性を増加させる凝集材料を除去した硫酸アンモニウム処理。次に、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行して、バックグラウンドタンパク質の大部分を排除しながら、最終ステップとしてイオン交換カラムに直接適用するのに適した低イオンバッファーでGFPと融合を溶出させました。3つの細胞内タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（SEAP）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、それぞれGFPに融合し、GFP自体が70％を超え、純度レベルを80％超えて回収しました。この浄化スキームは、不安定な融合パートナーのための穏やかな環境を維持しながら、GFPの疎水性の性質を悪用します。ある程度の最適化が必要になるかもしれませんが、このスキームは他のGFP融合タンパク質を浄化するためのベンチマークとして役立つと考えています。

Green fluorescence protein (GFP) has become a widely used reporter in many areas of life science. Monitoring foreign protein expression via GFP fusion is also very appealing for bioprocess applications. GFP itself has been purified from recombinant organisms by several methods, often involving unfavorable conditions (e.g., use of organic solvents and/or low pH) that may be destabilizing to some proteins. In this study, we have developed a general recovery scheme that entails a simple three-step purification procedure for GFP fusion proteins produced in tobacco suspension cells, with the intent of maximizing purity and yield under gentle conditions so as to maintain the integrity of the fusion partner. Ammonium sulfate treatment at 30% (v/v) precipitated particulate matter and removed aggregated material while simultaneously maintaining GFP solubility and increasing hydrophobicity. Hydrophobic interaction chromatography was then performed to eliminate the majority of background proteins while eluting GFP and fusions in a low ionic buffer suitable to be directly applied to an ion-exchange column as the final step. Three intracellular proteins, secreted alkaline phosphatase (SEAP), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GMCSF), each fused to GFP, as well as GFP itself, were recovered with yields exceeding 70% and purity levels over 80%. This purification scheme exploits the hydrophobic nature of GFP while maintaining a gentle environment for labile fusion partners. Although some optimization may be required, we believe this scheme may serve as a benchmark for purifying other GFP fusion proteins.