エンドヌクレアーゼDNA結合と切断特異性の計算再設計

DNA結合特異性の再プログラミングは、タンパク質DNA認識の現在の理解をテストする計算タンパク質設計にとって重要な課題であり、バイオテクノロジーと医学にかなりの実用的な関連性を持っています。ここでは、身体的に現実的な原子レベルの力場を使用したイントロンエンコードエンドヌクレアーゼI-MSOIの切断特異性の計算再設計について説明します。インシリコスクリーンを使用して、野生型酵素による結合を破壊すると予測される単一の塩基対置換を特定し、モンテカルロサンプリングを使用してこれらのそれぞれの不利な置換の周りのアミノ酸のクラスターの同一性と立体構造を最適化しました。野生型結合親和性を維持しながら、変化した標的部位の特異性を示すと予測された再設計された酵素が実験的に特徴付けられました。再設計された酵素は、再設計された認識部位に結合して切断し、野生型酵素よりも約10,000倍効果的に切断され、元のエンドヌクレアーゼに匹敵する標的識別のレベルがあります。X線結晶学による再設計されたヌクレアーゼ認識部位複合体の構造の決定により、計算的に予測された界面の精度が確認されます。これらの結果は、計算タンパク質設計法が、遺伝子治療およびその他の用途のための新規高度に特異的なエンドヌクレアーゼの作成に重要な役割を果たすことができることを示唆しています。

The reprogramming of DNA-binding specificity is an important challenge for computational protein design that tests current understanding of protein-DNA recognition, and has considerable practical relevance for biotechnology and medicine. Here we describe the computational redesign of the cleavage specificity of the intron-encoded homing endonuclease I-MsoI using a physically realistic atomic-level forcefield. Using an in silico screen, we identified single base-pair substitutions predicted to disrupt binding by the wild-type enzyme, and then optimized the identities and conformations of clusters of amino acids around each of these unfavourable substitutions using Monte Carlo sampling. A redesigned enzyme that was predicted to display altered target site specificity, while maintaining wild-type binding affinity, was experimentally characterized. The redesigned enzyme binds and cleaves the redesigned recognition site approximately 10,000 times more effectively than does the wild-type enzyme, with a level of target discrimination comparable to the original endonuclease. Determination of the structure of the redesigned nuclease-recognition site complex by X-ray crystallography confirms the accuracy of the computationally predicted interface. These results suggest that computational protein design methods can have an important role in the creation of novel highly specific endonucleases for gene therapy and other applications.