細胞質ペプチドの部位特異的標識：N、n'-ジアセチルキトビオース関連化合物によるN-グリカカーゼ

ペプチド：N-グリカーナーゼ（PnGase）は、N結合グリコペプチドとグリコタンパク質からN結合グリカン鎖を放出する脱グリコシル化酵素です。最近の研究では、細胞質Pngaseが誤って折り畳まれた/組み立てられていない糖タンパク質の分解に関与していることが明らかになりました。この酵素には、酵素活性に必要なCys、His、およびASP触媒トライアドがあり、「遊離」n結合グリカンによって阻害される可能性があります。これらの観察により、強力な阻害剤としてのN-グリカンのハロ酢酸アミジル誘導体の使用の可能性を調査するようになり、この酵素の試薬を標識しました。出芽酵母（PNG1）の細胞質PnGaseを使用して、MAN9GLCNAC2-ヨードアセトアミドは、この酵素の強力な阻害剤であることが示されました。この阻害は、炭水化物のPNG1の単一Cys残基への共有結合結合を介してであることがわかっており、結合は非常に選択的でした。触媒トライアドのCys191がALAに変更された変異酵素は、炭水化物プローブに結合しなかったため、触媒Cysがこの化合物の結合部位であることを示唆しています。質量分析による炭水化物付着部位の正確な決定により、Cys191は共有結合の部位として明確に識別されました。タンパク質へのn、n'-ジアセチルキトビオース（キトビオース）結合の分子モデリングは、炭水化物結合部位がこの酵素のペプチドベースの阻害剤であるZ-Vad-fmkのそれとは異なるが隣接するものとは異なることを示唆しています。これらの結果は、細胞質Pngaseがチトビオースおよび他の炭水化物のための別個の結合部位を持っていることを示唆しており、ハロアセトアミド誘導体は非常に特異的な方法でその触媒Cysを不可逆的に阻害することを示唆しています。

Peptide:N-glycanase (PNGase) is the deglycosylating enzyme, which releases N-linked glycan chains from N-linked glycopeptides and glycoproteins. Recent studies have revealed that the cytoplasmic PNGase is involved in the degradation of misfolded/unassembled glycoproteins. This enzyme has a Cys, His, and Asp catalytic triad, which is required for its enzymatic activity and can be inhibited by "free" N-linked glycans. These observations prompted us to investigate the possible use of haloacetamidyl derivatives of N-glycans as potent inhibitors and labeling reagents of this enzyme. Using a cytoplasmic PNGase from budding yeast (Png1), Man9GlcNAc2-iodoacetoamide was shown to be a strong inhibitor of this enzyme. The inhibition was found to be through covalent binding of the carbohydrate to a single Cys residue on Png1, and the binding was highly selective. The mutant enzyme in which Cys191 of the catalytic triad was changed to Ala did not bind to the carbohydrate probe, suggesting that the catalytic Cys is the binding site for this compound. Precise determination of the carbohydrate attachment site by mass spectrometry clearly identified Cys191 as the site of covalent attachment. Molecular modeling of N,N'-diacetylchitobiose (chitobiose) binding to the protein suggests that the carbohydrate binding site is distinct from but adjacent to that of Z-VAD-fmk, a peptide-based inhibitor of this enzyme. These results suggest that cytoplasmic PNGase has a separate binding site for chitobiose and other carbohydrates, and haloacetamide derivatives can irreversibly inhibit that catalytic Cys in a highly specific manner.