GFPによるC elegansトランスジェニックアレイの視覚化

背景：大腸菌LACリプレッサー（LACI）を介して特定のDNA配列であるLAC演算子（LACO）に緑色蛍光タンパク質（GFP）を標的とすると、酵母および哺乳類細胞の染色体の視覚化が可能になります。原則として、この視覚化の方法は、簡単に採点できる細胞自動マーカーを必要とする遺伝的モザイク分析に使用できます。C. elegans Lin-3遺伝子は、表皮成長因子ファミリー（EGF）成長因子をコードしています。LIN-3はゴナダルアンカー細胞で発現し、let-23（膜貫通タンパク質チロシンキナーゼおよびEGF受容体のオーソログ）を介して作用し、外陰部前駆細胞をシグナルにして外陰部組織を生成します。LIN-3は後に外陰部細胞で発現し、最近の証拠は、LIN-3が外陰誘導中にリレー信号としてgul-3に作用する可能性を高めています。したがって、モザイク分析によりLIN-3の作用部位をテストすることは興味深いものです。 結果：大腸菌LACリプレッサー（LACI）を介して緑色蛍光タンパク質（GFP）を標的とすることにより、C。elegansの生体の導入遺伝子を視覚化しました。核局在したGFP-LACI融合タンパク質を発現するように動物を設計しました。ラコ導入遺伝子を有するC. elegans細胞は、核に局在する明るい斑点（すなわち、LACOに結合したGFP-LACI）をもたらします。びまん性の核蛍光を持つ細胞は、非結合核局在GFP-LACIに対応しています。LACOリピートシーケンスの配列を染色体的に統合し、統合された導入遺伝子をGFP-LACIと視覚化することにより、生きている動物の染色体を検出しました。この検出システムを適用して、倍数性を決定するだけでなく、染色体分離を調査することができます。GFP-LACI*LACOシステムをモザイク分析のマーカーとして評価するために、アンカー細胞で発現した表皮成長因子LIN-3の遺伝的モザイク分析を実施しました。アンカー細胞にLIN-3が作用して外陰部の発達を誘発することを確立し、導入遺伝子の存在を検出するこの方法の有用性を実証します。 結論：GFP-LACI*LACO導入遺伝子検出システムは、染色体および染色体外トランスゲンの視覚化のためにC. elegansで機能します。遺伝的モザイク分析のマーカーとして使用できます。染色体外配列としてのLACOリピートシーケンスは、アレイの自発的な喪失を迅速かつ正確に決定できる貴重な手法となり、それにより高解像度モザイク分析を可能にします。LIN-3遺伝子は、外陰部の発達を受けるために表皮外陰部前駆細胞を誘導するためにアンカー細胞で必要です。

BACKGROUND: Targeting the green fluorescent protein (GFP) via the E. coli lac repressor (LacI) to a specific DNA sequence, the lac operator (lacO), allows visualization of chromosomes in yeast and mammalian cells. In principle this method of visualization could be used for genetic mosaic analysis, which requires cell-autonomous markers that can be scored easily and at single cell resolution. The C. elegans lin-3 gene encodes an epidermal growth factor family (EGF) growth factor. lin-3 is expressed in the gonadal anchor cell and acts through LET-23 (transmembrane protein tyrosine kinase and ortholog of EGF receptor) to signal the vulval precursor cells to generate vulval tissue. lin-3 is expressed in the vulval cells later, and recent evidence raises the possibility that lin-3 acts in the vulval cells as a relay signal during vulval induction. It is thus of interest to test the site of action of lin-3 by mosaic analysis. RESULTS: We visualized transgenes in living C. elegans by targeting the green fluorescent protein (GFP) via the E. coli lac repressor (LacI) to a specific 256 sequence repeat of the lac operator (lacO) incorporated into transgenes. We engineered animals to express a nuclear-localized GFP-LacI fusion protein. C. elegans cells having a lacO transgene result in nuclear-localized bright spots (i.e., GFP-LacI bound to lacO). Cells with diffuse nuclear fluorescence correspond to unbound nuclear localized GFP-LacI. We detected chromosomes in living animals by chromosomally integrating the array of the lacO repeat sequence and visualizing the integrated transgene with GFP-LacI. This detection system can be applied to determine polyploidy as well as investigating chromosome segregation. To assess the GFP-LacI*lacO system as a marker for mosaic analysis, we conducted genetic mosaic analysis of the epidermal growth factor lin-3, expressed in the anchor cell. We establish that lin-3 acts in the anchor cell to induce vulva development, demonstrating this method's utility in detecting the presence of a transgene. CONCLUSION: The GFP-LacI*lacO transgene detection system works in C. elegans for visualization of chromosomes and extrachromosomal transgenes. It can be used as a marker for genetic mosaic analysis. The lacO repeat sequence as an extrachromosomal array becomes a valuable technique allowing rapid, accurate determination of spontaneous loss of the array, thereby allowing high-resolution mosaic analysis. The lin-3 gene is required in the anchor cell to induce the epidermal vulval precursors cells to undergo vulval development.