DNA二重鎖切断の修復：in vivo生化学

二重鎖切断（DSB）は、細胞のゲノムの完全性に損傷を引き起こし、遺伝子組換えプロセスを開始する可能性があります。出芽酵母からのHOおよびI-SCEIエンドヌクレアーゼは、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でユニークなDSBでin vivoを誘導することにより、これらのイベントを研究する方法を提供しました。GAL :: hoコンストラクトは、非母性末端結合、染色体内および染色体間遺伝子変換、単一鎖アニーリング、分裂誘発組換えなどのプロセスを研究するために広く使用されてきました。同期的に誘導されたDSBは、酵母のDNA損傷チェックポイント、適応、および回復経路の研究においても重要でした。この章では、GAL :: HOを使用してDSB後のイベントの進行を物理的に監視する方法について説明します。特に、HMLとHMRのサイレントドナーを使用したMATの遺伝子変換による交配型の切り替えにつながるイベントについて説明します。サザンブロット分析は、DSBや製品の形成など、このプロセスの全体的なイベントに従うために使用できます。変性アルカリゲルとスロットブロット技術を使用して、DSBから始まるDNAの5 'から3'の切除に従うことができます。切除後、3 '尾は相同性検索を開始し、その後、ストランドはドナーカセットでその相同シーケンスに侵入します。ポリメラーゼ連鎖反応は、遺伝子変換の完了だけでなく、鎖浸潤と新しいDNA合成のプライミングをアッセイする重要な手段です。クロマチン免疫沈降などの方法は、組換えタンパク質を含むDSBと関連するDSBと関連する多くのタンパク質を研究する手段を提供しているだけでなく、非等末端結合、細胞周期停止、クロマチンリモデリング、コーヘシン機能、およびミスマッチ修復に関与するタンパク質も提供しています。

Double strand breaks (DSBs) can cause damage to the genomic integrity of a cell as well as initiate genetic recombination processes. The HO and I-SceI endonucleases from budding yeast have provided a way to study these events by inducing a unique DSB in vivo under the control of a galactose-inducible promoter. The GAL::HO construct has been used extensively to study processes such as nonhomologous end joining, intra- and interchromosomal gene conversion, single strand annealing and break-induced recombination. Synchronously induced DSBs have also been important in the study of the DNA damage checkpoint, adaptation, and recovery pathways of yeast. This chapter describes methods of using GAL::HO to physically monitor the progression of events following a DSB, specifically the events leading to the switching of mating type by gene conversion of MAT using the silent donors at HML and HMR. Southern blot analysis can be used to follow the overall events in this process such as the formation of the DSB and product. Denaturing alkaline gels and slot blot techniques can be employed to follow the 5' to 3' resection of DNA starting at the DSB. After resection, the 3' tail initiates a homology search and then strand invades its homologous sequence at the donor cassette. Polymerase chain reaction is an important means to assay strand invasion and the priming of new DNA synthesis as well as the completion of gene conversion. Methods such as chromatin immunoprecipitation have provided a means to study many proteins that associate with a DSB, including not only recombination proteins, but also proteins involved in nonhomologous end joining, cell cycle arrest, chromatin remodeling, cohesin function, and mismatch repair.