細菌DNAリガーゼDのポリメラーゼ成分によるヌクレオチドの誤った組み込み、3'の不一致拡張、およびAbasic部位およびDNA付加物に対する反応

DNAリガーゼD（LIGD）は、細菌に結合する非相同末端の変異原性経路に関与しています。LIGDは、ポリメラーゼドメイン（POL）とホスホエステラーゼモジュールに融合したATP依存性リガーゼドメインで構成されています。POLドメインは、DNTPまたはRNTP基質のいずれかを使用して、テンプレートされたプライマー伸長反応を実行します。ここでは、Pseudomonas ligd Polは不誠実な核酸ポリメラーゼであると報告しています。ヌクレオチドの取り込みにおける不倫の程度は、生成された誤ったペアによって変化しますが、我々は、DNTPSPSPSを使用するよりもRNTP基質よりもはるかに迅速に加えられている、対応する正しいデオキシリボヌクレオチドおよび不正確なヌクレオチドよりも、正しいペアリボヌクレオチドがDNAプライマー末端に添加されることがわかります。、ミスペア構成に関係なく。3 'のペアのプライマーテンプレートよりもゆっくりとはいえ、3'の誤差がLigd Polによって拡張されていることがわかります。ミスマッチ拡張に対するレート効果の大きさは、3 'ミスペアの同一性によって異なりますが、一般に、DNTPよりもRNTP基質の方が誤った端がより速く拡張された場合がありました。これらの結果は、Ligd Polが静止細胞の二重鎖切断を修復する際にリボヌクレオチドで短い5'オーバーハングを埋める可能性があるという提案に信ence性を与えます。Ligd Polは、ゆっくりではあるが、テンプレート鎖の虐待性病変の反対側にデオキシヌクレオチドを追加できると報告しています。リボヌクレオチドは、デオキシよりも虐待性病変でより急速に挿入されます。Ligd Polは、Abasic部位に反対する事前に形成されたプライマー末端を拡張する際に弱い活動を示しますが、プライマー3 'Diまたはトリヌクレオチドの滑りと、虐待部位に遠位のテンプレートシーケンスへの再編成により、病変を容易にバイパスできます。共有ベンゾ[A]ピレンDGおよびベンゾ[C]テンプレート鎖のフェナントレンDA付加物は、耐久性のある障害物です。POLは、付加物の反対側のDNMPをゆっくりと挿入できますが、その後の拡張ステップで損なわれます。

DNA ligase D (LigD) participates in a mutagenic pathway of nonhomologous end joining in bacteria. LigD consists of an ATP-dependent ligase domain fused to a polymerase domain (POL) and a phosphoesterase module. The POL domain performs templated and nontemplated primer extension reactions with either dNTP or rNTP substrates. Here we report that Pseudomonas LigD POL is an unfaithful nucleic acid polymerase. Although the degree of infidelity in nucleotide incorporation varies according to the mispair produced, we find that a correctly paired ribonucleotide is added to the DNA primer terminus more rapidly than the corresponding correct deoxyribonucleotide and incorrect nucleotides are added much more rapidly with rNTP substrates than with dNTPs, no matter what the mispair configuration. We find that 3' mispairs are extended by LigD POL, albeit more slowly than 3' paired primer-templates. The magnitude of the rate effect on mismatch extension varies with the identity of the 3' mispair, but it was generally the case that mispaired ends were extended more rapidly with rNTP substrates than with dNTPs. These results lend credence to the suggestion that LigD POL might fill in short 5'-overhangs with ribonucleotides when repairing double strand breaks in quiescent cells. We report that LigD POL can add a deoxynucleotide opposite an abasic lesion in the template strand, albeit slowly. Ribonucleotides are inserted more rapidly at an abasic lesion than are deoxys. LigD POL displays feeble activity in extending a preformed primer terminus opposing an abasic site, but can readily bypass the lesion by slippage of the primer 3' di- or trinucleotide and realignment to the template sequence distal to the abasic site. Covalent benzo[a]pyrene-dG and benzo[c]phenanthrene-dA adducts in the template strand are durable roadblocks to POL elongation. POL can slowly insert a dNMP opposite the adduct, but is impaired in the subsequent extension step.