インテインを介したタンパク質精製システムにおける標的タンパク質とインテイン間のin vivo切断の除去

Impactは、ニューイングランドBiolabsによって開発された新しいタンパク質精製システムです。このシステムは、タンパク質スプライシング要素（インテインと呼ばれる）の誘導性の自己切断活性を利用して、プロテアーゼを使用せずに標的タンパク質からアフィニティインテインCBDタグから分離します。インパクトシステムは、簡単でワンステップのタンパク質精製手順として広く使用されています。ただし、衝撃は通常、PETシステムなど、他のタンパク質精製システムよりも低い標的タンパク質収量を生成します。多くの場合、標的タンパク質の収率が低いのは、タンパク質発現中の標的タンパク質とインテインの間のin vivo切断によるものであることがわかった。自己切断では、インテインの最初の残留物が遊離スルフヒドリル基を持つシステインであることを必要とします。これをin vivoの自動切断を排除するために、最初のシステインによる潜在的なジスルフィド結合形成を可能にするために、インテインタンパク質に2つの単一システイン変異体を設計しました。したがって、インテインの最初のシステインには、タンパク質発現中に利用可能な遊離スルフヒドリル基はありません。我々のデータは、細菌発現中の生体内自己切断がインテイン変異により完全に排除され、他の高レベル発現システムに匹敵する衝撃発現システムのタンパク質収率が大幅に増加することを示した。

IMPACT is a novel protein purification system developed by New England BioLabs. This system utilizes the inducible self-cleavage activity of a protein splicing element (termed intein) to separate the target protein from the affinity intein-CBD tag without using any proteases. The IMPACT system has been widely used as an easy, one-step protein purification procedure. However, IMPACT usually produces a lower target protein yield than other protein purification systems, such as the pET system. It was found that the lower yield of the target protein, in many cases, was due to in vivo cleavage between the target protein and the intein during protein expression. Self-cleavage requires the first residue of the intein to be a cysteine with a free sulfhydryl group. In order to eliminate this in vivo auto-cleavage, we designed two single cysteine mutants in the intein protein to allow potential disulfide bond formation with the first cysteine. Therefore, no free sulfhydryl group in the first cysteine of the intein is available during protein expression. Our data indicated that the in vivo auto-cleavage during bacterial expression was completely eliminated with the intein mutation, resulting in a significant enhancement of the protein yield of the IMPACT expression system, comparable to the other high-level expression systems.