アミノ酸とマンガンの補給は、CHO培養システムにおけるエリスロポエチンのグリコシル化状態を調節します

分泌されたタンパク質の製造は、高レベルの発現と新生のポリペプチドの適切な処理の両方の必要性によって複雑になります。エリスロポエチン（EPO）などの糖タンパク質の場合、翻訳後処理にはオリゴ糖鎖の添加が含まれます。当初、細胞培養培地に存在するアミノ酸のサブセットが、バッチFEDシステムの最後の収穫サイクル中に細胞代謝によって枯渇し、これらの栄養素を補充することによりEPOの収量を改善すると仮定したことに留意しました。これらのアミノ酸の濃度を増加させることにより、予想どおりに最後の収穫サイクルで組換えヒトエリスロポエチン（Rhuepo）生合成を増加させましたが、驚くべきことに、比較的低いシアル酸含有量でRhuepoの量の大幅な増加も観察されました。このプロセスの性質を理解するために、より低いシアリル化Rhuepoプールを分離し、特徴付けました。シアリル化の減少は、末端ガラクトース部分を欠いているN結合炭水化物の増加と相関しており、ベータ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼがシステムの速度制限である可能性があることを示唆しています。この仮説をテストするために、私たちの培養物に、ベータ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼの補因子であるさまざまな濃度のマンガン（Mn（2+））を補充しました。私たちの仮説と一致して、Mn（2+）添加がガラクトシル化を改善し、より低いシアリル化画分のrhuepoの量を大幅に減少させることがわかりました。さらに、Mn（2+）添加が炭水化物の占有性を増加させ、炭水化物の分岐がこれらの低いシアリル化プールの双角構造に縮小することがわかりました。驚くべきことに、Mn（2+）は、文化プロセスの後半でこの効果しかありませんでした。これらのデータは、Mn（2+）の添加がストレスのあるバッチFed培養に複雑な影響を与えることを示しています。

The manufacture of secreted proteins is complicated by the need for both high levels of expression and appropriate processing of the nascent polypeptide. For glycoproteins, such as erythropoietin (EPO), posttranslational processing involves the addition of oligosaccharide chains. We initially noted that a subset of the amino acids present in the cell culture media had become depleted by cellular metabolism during the last harvest cycle in our batch fed system and hypothesized that by supplementing these nutrients we would improve EPO yields. By increasing the concentration of these amino acids we increased recombinant human erythropoietin (rHuEPO) biosynthesis in the last harvest cycle as expected but, surprisingly, we also observed a large increase in the amount of rHuEPO with a relatively low sialic acid content. To understand the nature of this process we isolated and characterized the lower sialylated rHuEPO pool. Decreased sialylation correlated with an increase in N-linked carbohydrates missing terminal galactose moieties, suggesting that beta-1,4-galactosyltransferase may be rate limiting in our system. To test this hypothesis we supplemented our cultures with varying concentrations of manganese (Mn(2+)), a cofactor for beta-1,4-galactosyltransferase. Consistent with our hypothesis we found that Mn(2+) addition improved galactosylation and greatly reduced the amount of rHuEPO in the lower sialylated fraction. Additionally, we found that Mn(2+) addition increased carbohydrate site occupancy and narrowed carbohydrate branching to bi-antennary structures in these lower sialylated pools. Surprisingly Mn(2+) only had this effect late in the culture process. These data indicate that the addition of Mn(2+) has complex effects on stressed batch fed cultures.