質量分析、同位体コード化された架橋剤、および統合された計算データ処理を使用したタンパク質架橋分析

タンパク質とタンパク質複合体の距離制約は、3D構造の計算、タンパク質結合パートナーの同定、タンパク質間接触部位の局在化のための非常に貴重な情報を提供します。LC-Maldiタンデム質量分析とコンピューターソフトウェアを使用して、同位体コード化されたクロスリンカーによって化学的に架橋されたタンパク質から派生したタンパク質分解生成物の分析を通じて、そのような部位を識別および特性化するための統合的アプローチを開発しました。この方法は、低マイクログラム量のタンパク質または非ラベル標識および重塩標識Bis-NHSエステル架橋試薬と架橋された多量体タンパク質複合体の迅速な分析に向けて特異的に調整されています（両方とも市販と容易に合成されます）。[18O]水溶媒とLC-Maldi分析でのラベル付けにより、この方法により、タイプ0とタイプ1またはタイプ2の修飾ペプチド（モノリンクとループリンクまたはクロスリンク）の可能な区別がさらに可能になりますが、そのような区別はより容易に行われます。タンデム質量分析データの分析から。細菌のコリシンE7 DNASE/IM7ヘテロダイマータンパク質複合体に適用すると、ヘテロダイマーのX線構造のコンテキストで調べたときに空間に近い残基間で、6つのサブユニット間架橋を含む23の架橋が特定されました。さらに、架橋は、5つの単一サブユニットタンパク質、ベータラクトグロブリン、シトクロムC、リゾチーム、ミオグロビン、およびリボヌクレアーゼAで正常に特定され、アプローチの一般性を確立しました。

Distance constraints in proteins and protein complexes provide invaluable information for calculation of 3D structures, identification of protein binding partners and localization of protein-protein contact sites. We have developed an integrative approach to identify and characterize such sites through the analysis of proteolytic products derived from proteins chemically cross-linked by isotopically coded cross-linkers using LC-MALDI tandem mass spectrometry and computer software. This method is specifically tailored toward the rapid analysis of low microgram amounts of proteins or multimeric protein complexes cross-linked with nonlabeled and deuterium-labeled bis-NHS ester cross-linking reagents (both commercially available and readily synthesized). Through labeling with [18O]water solvent and LC-MALDI analysis, the method further allows the possible distinction between Type 0 and Type 1 or Type 2 modified peptides (monolinks and looplinks or cross-links), although such a distinction is more readily made from analysis of tandem mass spectrometry data. When applied to the bacterial Colicin E7 DNAse/Im7 heterodimeric protein complex, 23 cross-links were identified including six intersubunit cross-links, all between residues that are close in space when examined in the context of the X-ray structure of the heterodimer. In addition, cross-links were successfully identified in five single subunit proteins, beta-lactoglobulin, cytochrome c, lysozyme, myoglobin, and ribonuclease A, establishing the generality of the approach.