ヒト免疫不全ウイルストランス活性化応答要素のRNA転写産物は、ウイルストランス活性化因子の作用を阻害する可能性があります

ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）のトランス活性化応答要素（TAR）のタンデムリピートは、特別に構築された「タンデミー化」プラスミド、PGEM-TANを使用して生成されました。このプラスミドは、挿入されたシーケンスの複数のコピーを生成するために、AVA I制限部位の回転式非等価を利用します。タールの12回のタンデムリピートは、強力なヒトベータアクチン遺伝子プロモーターの背後にある意味とアンチセンスの向きに配置されました。TARコンストラクトは、適切なHIV-1駆動型レポーターとTAT遺伝子発現プラスミドをNT2/D1細胞にトランスフェクトしました。12のタンデムタールが感覚の向きで繰り返され、ウイルスにエンコードされたTATタンパク質のトランスアクティブ機能の85〜90％が抑制されましたが、アンチセンスコンストラクトまたはアンチセンス方向の単一コピーを含むコンストラクトは比較的効果がありませんでした。抑制は、無傷のHIV-1ロング末端繰り返しを含むレポーター遺伝子コンストラクトに特異的でした。他のプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子、またはTARを欠くHIV-1ロング末端リピートによって抑制されませんでした。TATによる活性化の抑制には、RNAへの転写が必要でした。TARを含む同様のコンストラクトを繰り返しますが、真核生物プロモーターを欠くことは、TATの活性化を抑制できませんでした。TATがない場合、TAR DNAは、HIV-1ロング末端繰り返しだけでなく、ヒトベータアクチン遺伝子とSimianウイルス40プロモーターによって駆動される遺伝子構築物の発現を2〜5倍刺激しました。

Tandem repeats of the transactivation response element (TAR) of the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) were generated using a specially constructed "tandemizing" plasmid, pGem-Tan. This plasmid exploits the rotational nonequivalence of Ava I restriction sites to generate multiple copies of an inserted sequence. Twelve tandem repeats of the TAR were then placed in sense and antisense orientations behind a strong human beta-actin gene promoter. The TAR constructs were transfected with an appropriate HIV-1-driven reporter and tat gene expression plasmids into NT2/D1 cells, a pluripotential human embryonic teratocarcinoma cell line. Twelve tandem TAR repeats in the sense orientation suppressed 85-90% of the transactivating function of the virus-encoded tat protein, whereas the antisense construct or constructs containing single copies of TAR in either sense or antisense orientations were relatively ineffective. The suppression was specific for reporter gene constructs containing an intact HIV-1 long terminal repeat: Reporter genes driven by other promoters or by an HIV-1 long terminal repeat lacking the TAR were not suppressed. Suppression of activation by tat required transcription into RNA: Similar constructs containing the TAR repeats but lacking a eukaryotic promoter failed to suppress tat activation. In the absence of tat, the TAR DNA stimulated 2- to 5-fold the expression of gene constructs driven not only by the HIV-1 long terminal repeat but also by the human beta-actin gene and the simian virus 40 promoters.