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植物のミトコンドリアRNAの処理のメカニズムを調査するために、ご相も溶けやすい抽出物における小麦ミトコンドリアTRNA前駆体の運命を研究しました。T3またはT7 RNAポリメラーゼと小麦ミトコンドリアTRNA遺伝子と隣接配列を含むDNAテンプレートを使用して、人工前駆体転写産物をin vitroで合成しました。ミトコンドリア抽出物は、ネイティブと葉緑体様の両方の前駆体の処理をサポートしていることがわかりました（Joyce、P。B. M.、およびGray、M。W.（1989）核酸Res。77、5461-5476）小麦ミトコンドリアtRNAシーケンス。前駆体転写産物と抽出物とのインキュベーションにより、正確な5'-および3'-エンド有核分解性切断を介したTRNAの処理が行われます。ただし、5'leader + tRNAとtRNA + 3'-トレーラーで構成される中間体は、反応の過程で同時に存在するため、これらの切断はin vitroで注文されません。加工生成物の配列分析により、予想される位置でエンド核分解切断が発生し、5'-ホスホリルおよび3'-ヒドロキシル末端でTRNAを生成することが確認されました。ミトコンドリア抽出物には、加工されたTRNAの3'エンドに-ccaoh末端を追加するtRNAヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性も含まれています。この細胞を含まないRNA処理システムは、植物ミトコンドリアTRNAの生産と成熟に関与するさまざまな酵素の生化学的特性評価の基礎を提供します。
植物のミトコンドリアRNAの処理のメカニズムを調査するために、ご相も溶けやすい抽出物における小麦ミトコンドリアTRNA前駆体の運命を研究しました。T3またはT7 RNAポリメラーゼと小麦ミトコンドリアTRNA遺伝子と隣接配列を含むDNAテンプレートを使用して、人工前駆体転写産物をin vitroで合成しました。ミトコンドリア抽出物は、ネイティブと葉緑体様の両方の前駆体の処理をサポートしていることがわかりました（Joyce、P。B. M.、およびGray、M。W.（1989）核酸Res。77、5461-5476）小麦ミトコンドリアtRNAシーケンス。前駆体転写産物と抽出物とのインキュベーションにより、正確な5'-および3'-エンド有核分解性切断を介したTRNAの処理が行われます。ただし、5'leader + tRNAとtRNA + 3'-トレーラーで構成される中間体は、反応の過程で同時に存在するため、これらの切断はin vitroで注文されません。加工生成物の配列分析により、予想される位置でエンド核分解切断が発生し、5'-ホスホリルおよび3'-ヒドロキシル末端でTRNAを生成することが確認されました。ミトコンドリア抽出物には、加工されたTRNAの3'エンドに-ccaoh末端を追加するtRNAヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性も含まれています。この細胞を含まないRNA処理システムは、植物ミトコンドリアTRNAの生産と成熟に関与するさまざまな酵素の生化学的特性評価の基礎を提供します。
To investigate mechanisms for processing of plant mitochondrial RNAs, we studied the fate of wheat mitochondrial tRNA precursors in a homologous soluble extract. Artificial precursor transcripts were synthesized in vitro using T3 or T7 RNA polymerase and DNA templates containing wheat mitochondrial tRNA genes and flanking sequences. We found that the mitochondrial extract supports processing of precursors containing both native and chloroplast-like (Joyce, P. B. M., and Gray, M. W. (1989) Nucleic Acids Res. 77, 5461-5476) wheat mitochondrial tRNA sequences. Incubation of precursor transcripts with the extract results in processing of tRNAs via precise 5'- and 3'-endonucleolytic cleavages. However, these cleavages are not ordered in vitro because intermediates composed of 5'-leader + tRNA and tRNA + 3'-trailer are present simultaneously throughout the course of the reaction. Sequence analysis of processed products confirmed that endonucleolytic cleavages occur at the expected positions, generating tRNAs with 5'-phosphoryl and 3'-hydroxyl termini. The mitochondrial extract also contains a tRNA nucleotidyltransferase activity that adds -CCAOH termini to the 3'-ends of processed tRNAs. This cell-free RNA processing system provides the basis for biochemical characterization of the various enzymes involved in the production and maturation of plant mitochondrial tRNAs.
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