受信機ドメインポイント変異体の表現型分析によって決定されるカンジダアルビカンスのSSK1P応答調節タンパク質の機能研究

カンジダアルビカンス応答レギュレータータンパク質SSK1pは、MAPK Hog1経路を介して酸化剤の適応を調節します。SSK1を欠く欠失変異体はin vitroで酸化剤に敏感であり、ヒト好中球によって野生型（WT）細胞よりも殺されます。さらに、変異体は侵襲性マウスモデルでは潜在的であり、ヒト食道細胞に付着することができません。転写プロファイリングは、細胞壁とストレス適応機能をコードする遺伝子で、すべての変化の約25％が発生することを示しています。この研究では、d556（タンパク質リン酸化の推定部位）およびd513で点変異体を構築することにより、Ssk1p受信機（または調節）ドメインにおけるアミノ酸残基の役割を調査しました（二価金属結合、リン酸化、および配座スイッチングにおける推定役割の役割）。各点変異体について、さまざまな酸化剤ストレス条件に対する感受性を評価し、各SSK1P受信ドメインのin vitroリン酸化、HoG1P MAPキナーゼのリン酸化、および核への転座と相関しました。d5556n変異体は、Hog1pがD556N変異体でリン酸化されていても、遺伝子ノックアウトSSK1変異体と同様に、5 mm H（2）O（2）またはT-ブチルヒドロペルオキシドに敏感であることを示しています。この見かけのパラドックスを解決するために、D556N変異体の核へのHoG1P転座がWT細胞と比較して大幅に減少することも示します（CAF2-1）。2番目の点変異体では、D513がリジン残基（D513K）に変更されました。この変異体は過酸化物に対する抵抗性のWTレベルを持っていましたが、WT細胞およびD556N変異体と比較して、形態形成（酵母から菌糸への移行）は、10％血清または37度CでM-199培地で阻害されました。、Hog1pの構成的リン酸化が観察され、非保守的な変化（D513K）が活性な立体構造にSSK1Pをトラップし、したがって構成的HoG1Pリン酸化をトラップすることを示唆しています。D513Kにおける形態形成の阻害は、形態形成、EFG1およびCPH1の転写因子のダウンレギュレーションに関連しています。別の非保存点変異体（D556R）も構築され、表現型はD513K変異体のようなものでした。D556NおよびD513K変異体の受信ドメインは、in vitroでそれほどリン酸化できなかったため、SSK1Pが少なくともD513K変異体でリン酸化できないため、Hog1pの構成的活性化がin vivoで発生することを示しています。上記のSSK1P応答調節因子で説明した非保守的な変化は、HOGに依存しているD556N変異体と比較して表現型の違いを説明するSSK1Pの立体構造の変化を引き起こす可能性があると推測します。

The Candida albicans response regulator protein Ssk1p regulates oxidant adaptation through the MAPK HOG1 pathway. Deletion mutants lacking SSK1 are oxidant sensitive in vitro and are killed more than wild-type (WT) cells by human neutrophils. Furthermore, the mutants are avirulent in an invasive murine model, and unable to adhere to human esophageal cells. Transcriptional profiling has indicated that approximately 25% of all changes occur in genes encoding cell wall and stress adaptation functions. In this study, we have investigated the role of amino acid residues in the Ssk1p receiver (or regulatory) domain by constructing point mutants at positions D556 (putative site of protein phosphorylation) and D513 (putative role in divalent metal binding, phosphorylation and conformational switching). For each point mutant, their sensitivity to a variety of oxidant stress conditions was assessed and correlated with in vitro phosphorylation of each Ssk1p receiver domain, phosphorylation of the Hog1p MAP kinase, and translocation to the nucleus. We show that a D556N mutant is sensitive to 5 mM H(2)O(2) or t-butyl hydroperoxide, similar to a gene knock-out ssk1 mutant, even though Hog1p is phosphorylated in the D556N mutant. To resolve this apparent paradox, we also demonstrate that Hog1p translocation to the nucleus in the D556N mutant is significantly reduced compared with WT cells (CAF2-1). In a second point mutant, D513 was changed to a lysine residue (D513K). This mutant had WT levels of resistance to peroxide, but in comparison to WT cells and the D556N mutant, morphogenesis (yeast to hyphae transition) was inhibited in 10% serum or in M-199 medium at 37 degrees C. In the D513K point mutant, constitutive phosphorylation of Hog1p was observed, suggesting that a non-conservative change (D513K) traps Ssk1p in an active conformation and therefore constitutive Hog1p phosphorylation. The inhibition of morphogenesis in D513K is related to a downregulation of the transcription factors of morphogenesis, EFG1 and CPH1. Another non-conserved point mutant (D556R) was also constructed and phenotypically was like the D513K mutant. The receiver domains of the D556N and the D513K mutants could not be appreciably phosphorylated in vitro indicating that constitutive activation of Hog1p occurs in vivo due to the inability of Ssk1p to be phosphorylated at least in the D513K mutant. We speculate that the non-conservative changes described above in Ssk1p response regulator may cause conformational changes in the Ssk1p that account for phenotype differences compared with the D556N mutant that are also Hog-independent.