ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲルからポリビニリデンジフルオリド膜にエレクトロブロットされた糖タンパク質の直接炭水化物分析

ポリ・ビニリデン・ジフルオリド膜に電気転写された糖タンパク質の炭水化物分析の手順が記載されています。糖タンパク質（植物レクチン、トランスフリン、およびビトロネクチン）は、最初にドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離され、次に膜に電気ブロットされました。クーマシーブリリアントブルーR-250で染色することで視覚化された糖タンパク質バンドのそれぞれを膜から切除し、中性糖およびヘキソサミンの場合、または0.05 M H2SO4の100°Cの2.5 mトリフルオロ酢酸のいずれかで直接加水分解を誘導します。シアル酸の80度Cで1時間。得られた加水分解物は、高性能液体クロマトグラフィーの3つの異なるシステムによって、中性糖、ヘキソサミン、およびシアル酸について独立して分析されました。分析値は合理的な精度で再現可能であり、57〜66％の回収率で予想されるものと合意しました。この方法は、Sophora Japonica Barkのマンノース特異的レクチンに正常に適用されました。4つのサブユニットはSDS-PAGEだけで分離できるため、この方法は炭水化物の組成を決定するのに役立ちました。そのうちの3つは、植物起源のN結合されたオリゴ糖に典型的な炭水化物を含むことが示されました。これは、さまざまな西洋ワラディッシュペルオキシダーゼ標識レクチンを使用して膜で行われた結合アッセイの結果とよく一致しました。

A procedure for the carbohydrate analysis of glycoproteins electrotransferred to a polyvinylidene difluoride membrane is described. The glycoproteins (plant lectins, transferrin, and vitronectin) were first separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and then electroblotted onto a membrane. Each of the glycoprotein bands visualized by staining with Coomassie brilliant blue R-250 was excised from the membrane and subjected to direct hydrolysis either in 2.5 M trifluoroacetic acid at 100 degrees C for 6 h for neutral sugars and hexosamines, or in 0.05 M H2SO4 at 80 degrees C for 1 h for sialic acids. The hydrolysate obtained was analyzed for neutral sugars, hexosamines, and sialic acids independently by three different systems of high-performance liquid chromatography. The analytical values were reproducible with reasonable accuracy and agreed with those expected with recoveries of 57-66%. The method was successfully applied to a mannose-specific lectin of Sophora japonica bark, which is composed of four different subunits that aggregate sugar specifically. Because the four subunits could be separated by SDS-PAGE alone, the method proved useful for determining their carbohydrate compositions. Three of them were shown to contain carbohydrates typical of N-linked oligosaccharides of plant origin, which agreed well with the results of the binding assay carried out on a membrane using various horseradish peroxidase-labeled lectins.