バクテリオファージポータルアセンブリの不均一性を調査するための相補的なツールとしての高分子質量分析と電子顕微鏡法

電子クリオ顕微鏡（CRYO-EM）の成功と、ウイルスやバクテリオファージポータルなどの環状オリゴマーの画像再構成は、対称性の正確な知識に依存します。画像分析の多くの統計的方法は、この問題に対処していますが、多くの場合、明確な結果を提供しません。サブユニットの数が大きく、1つのサブユニットがオリゴマーのフルサイズにわずかな増分しかレンダリングしない場合、マルチサブユニットタンパク質アセンブリのオリゴマー状態の直接測定は困難です。さらに、分析遠心分離やサイズ排除クロマトグラフィーなどのさまざまな静脈腫の混合物が存在する場合、あまり役に立ちません。ここでは、エレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して、430 kDaから約100万daまでの質量の範囲であるファージP22、Phi-29、およびSPP1のin vitro組み立てられたポータルオリゴマーのオリゴマー状態を直接決定します。私たちのデータは、PHI-29およびSPP1ポータルのオリゴマー状態が、それぞれ結晶学および電子顕微鏡データとよく一致していることを明確に明らかにしています。ただし、in vitro組み立てられたP22ポータルは、それぞれ2：1のほぼ比率で11種と12マーの種の混合物でした。その後のP22ポータルの電子顕微鏡画像のその後の基準アライメントにより、このオリゴマー状態の混合物が確認されました。高分子質量分析は、オリゴマー状態の測定とアセンブリの対称性を助けることができる構造生物学の貴重なツールであり、cryo-emデータの画像分析を改善するための良い出発点を提供すると結論付けています。

The success of electron-cryo microscopy (cryo-EM) and image reconstruction of cyclic oligomers, such as the viral and bacteriophage portals, depends on the accurate knowledge of their order of symmetry. A number of statistical methods of image analysis address this problem, but often do not provide unambiguous results. Direct measurement of the oligomeric state of multisubunit protein assemblies is difficult when the number of subunits is large and one subunit renders only a small increment to the full size of the oligomer. Moreover, when mixtures of different stochiometries are present techniques such as analytical centrifugation or size-exclusion chromatography are also less helpful. Here, we use electrospray ionization mass spectrometry to directly determine the oligomeric states of the in vitro assembled portal oligomers of the phages P22, Phi-29 and SPP1, which range in mass from 430 kDa to about 1 million Da. Our data unambiguously reveal that the oligomeric states of Phi-29 and SPP1 portals were 12 and 13, respectively, in good agreement with crystallographic and electron microscopy data. However, in vitro assembled P22 portals were a mixture of 11- and 12-mer species in an approximate ratio of 2:1, respectively. A subsequent reference-free alignment of electron microscopy images of the P22 portal confirmed this mixture of oligomeric states. We conclude that macromolecular mass spectrometry is a valuable tool in structural biology that can aide in the determination of oligomeric states and symmetry of assemblies, providing a good starting point for improved image analysis of cryo-EM data.