ウシ好中球反応性酸素種の測定のためのアッセイの評価

乳房炎や牛の他の細菌媒介性疾患中、好中球は宿主の自然免疫反応において重要な役割を果たします。好中球は、感染部位に補充された初期の白血球の1つであり、細菌を食い物に植えて殺す能力を通じて自然免疫防御に寄与します。好中球の殺菌活性は、反応性酸素種（ROS）の生成によって部分的に媒介されます。ROSの細胞外放出は、宿主組織にも損傷を誘発する可能性があり、ROSの異常な放出は、特定の炎症性媒介疾患の病因に関係しています。細菌のクリアランスにおけるそれらの本質的な役割と、他の疾患の病因への関与の関与により、好中球生成ROSの研究には多くの関心があります。ROS産生を測定するためにいくつかのアッセイが開発されましたが、これらの多くはウシ好中球で評価されていません。現在の研究の目的は、ウシ好中球ROSを測定できるさまざまなアッセイを評価し、ウシ好中球でこれまでにテストされたことのないアッセイの結果を、これらの細胞で頻繁に使用したより確立されたアッセイから得られたアッセイと比較することでした。ルミノール、アイソミオルミール、メチルシプリジナルシフェリン類似体（MCLA）化学発光アッセイを含む8つの異なるアッセイが評価されました。Amplex Red、Dihydroethidium（DHE）、ジクロロジヒドロフルオレオレセインジアセテート（CM-H（2）DCFDA）、およびジヒドロロダミン123蛍光アッセイ。そして、シトクロムC吸光度アッセイ。アッセイは、好中球の活性化、ホルボール12-ミリステート、13-アセテート（PMA）、およびオプソン化されたザイモサンを誘導するために一般的に使用される2つのアゴニストに応答して生成されたROSを検出する能力の文脈で評価されました。NADPHオキシダーゼ阻害剤であるジフェニレンヨウソニウム塩化物は、ROSを検出するアッセイの特異性を評価するために使用されました。これらのアッセイが細胞内ROSと細胞外ROSを識別し、異なるROSを特異的に検出する能力を、それぞれスーパーオキシドジスムターゼとカタラーゼを使用して評価されました。DHEアッセイを除き、すべてのアッセイはPMAおよびZymosanによって誘発されたウシ好中球ROS生成を検出しました。Zymosanではなく、PMAは、DHEで検出可能なレベルでROSの好中球生成を刺激することができました。MCLA化学発光アッセイは、PMAとZymosanの最も低い濃度のそれぞれに応答して生成されたROSを検出した唯一のアッセイでした。私たちの知る限り、これは、ウシ好中球ROSの測定のためのDHE-、MCLA-、Amplex Red-、およびIsoluminolベースのアッセイを評価した最初の研究であり、同様の実験条件下でのROSアッセイの最も包括的な比較研究です。

During mastitis and other bacterial-mediated diseases of cattle, neutrophils play a critical role in the host innate immune response to infection. Neutrophils are among the earliest leukocytes recruited to the site of infection and contribute to host innate immune defenses through their ability to phagocytose and kill bacteria. The bactericidal activity of neutrophils is mediated, in part, through the generation of reactive oxygen species (ROS). Extracellular release of ROS can induce injury to host tissue as well, and aberrant release of ROS has been implicated in the pathogenesis of certain inflammatory-mediated diseases. Due to their essential role in bacterial clearance and implicated involvement in the pathogenesis of other diseases, there is much interest in the study of neutrophil-generated ROS. Several assays have been developed to measure ROS production, however, many of these have not been evaluated with bovine neutrophils. The objectives of the current study were to evaluate different assays capable of measuring bovine neutrophil ROS, and to compare the results of assays never previously tested with bovine neutrophils to those obtained from more well-established assays frequently used with these cells. Eight different assays were evaluated, including: luminol, isoluminol, and methyl cypridina luciferin analog (MCLA) chemiluminescence assays; Amplex Red, dihydroethidium (DHE), dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H(2)DCFDA), and dihydrorhodamine 123 fluorescence assays; and the cytochrome c absorbance assay. The assays were evaluated in the context of their abilities to detect ROS produced in response to two agonists commonly used to induce neutrophil activation, phorbol 12-myristate, 13-acetate (PMA) and opsonized zymosan. Diphenyleneiodonium chloride, a NADPH oxidase inhibitor, was used to assess the specificity of the assays to detect ROS. The ability of these assays to discriminate between intra- and extracellular ROS and to specifically detect distinct ROS was evaluated using superoxide dismutase and catalase, which scavenge extracellular superoxide and hydrogen peroxide, respectively. With the exception of the DHE assay, all assays detected bovine neutrophil ROS generation elicited by PMA and zymosan. PMA, but not zymosan, was able to stimulate neutrophil generation of ROS at levels that were detectable with DHE. The MCLA chemiluminescence assay was the only assay that detected ROS produced in response to each of the lowest concentrations of PMA and zymosan tested. To our knowledge, this is the first study to evaluate DHE-, MCLA-, Amplex Red-, and isoluminol-based assays for the measurement of bovine neutrophil ROS, and the most comprehensive comparative study of ROS assays under similar experimental conditions.