実験的な脈絡膜血管新生のための新しいイメージング技術

目的：脈絡膜血管新生（CNV）は、失明につながるいくつかの眼疾患の終点です。著者は、実験的なレーザー誘導CNVに関連する形態学的変化を視覚化および定量化するためのイメージング技術を開発しました。 方法：CNVは、レーザーエネルギーを使用してブルーシュの膜を破壊しました。ラットは、レーザー損傷の直後および1、2、3、4、7、14、および60日で安楽死しました。非レーザー化された目をコントロールとして使用しました。目を除核で固定し、後眼カップを核（DAPI; 4 '、6'-ジアミノ-2-フェニルインドール）、内皮細胞（イソレクチンIB4）、ミクログリア（CD11B）、およびファイラメントアクチンのマーカーで蛍光標識に標識しました。ファロイジン）。FITC-Dextran灌流を私たちの手法と比較しました。共焦点顕微鏡を使用して、平坦な標本を評価しました。コンピューターソフトウェアは、共焦点画像スタックの定性的および定量的分析のために3次元再構成を生成しました。 結果：非レーザー領域では、RPE細胞を均一な六角形アレイとして視覚化しました。レーザー曝露の直後に、蛍光標識のない円形領域が観察され、脈絡膜-Bruchの膜RPE複合体の破壊が示されました。レーザー曝露の1日後、細胞の破片と断片化された核が存在し、ブルーシュの膜破壊の部位で自己蛍光輪が見えました。リングは、バブル形成とCNV誘導と相関していました。レーザー損傷の3日後、ファロイジン標識RPE細胞とイソレクチン標識内皮細胞は大幅に増加し、細胞の増殖と移動を反映しました。4日目までに、血管チューブを形成するアイソレクチン陽性細胞を視覚化しました。CNV容器の量は、今後3日間に指数関数的に増加しました。7日までに、明確に定義されたアイソレクチン標識CNVネットワークが存在し、その量は数週間保存されました。FITC-Dextran灌流に基づいて計算されたCNVボリュームは、レクチン標識サンプルを使用して得られた量よりも有意に低かった。 結論：ラット脈絡膜/RPEフラットマウントにおけるレーザー誘導CNV病変の3次元の再構築と測定を可能にする新しいイメージング技術が開発されました。この手法は優れた形態学的詳細を提供し、Bruchの膜の破裂や血管形成前の内皮クラスターの形成など、CNVの重要な初期イベントの研究を促進します。CNV複合体は、FITC-Dextran灌流よりも初期の段階で、より再現性が高いほど標識されており、抗血管新生分子のより正確な前臨床評価を提供します。

PURPOSE: Choroidal neovascularization (CNV) is the end point of several ocular diseases that lead to blindness. The authors developed an imaging technique for visualizing and quantifying morphologic changes associated with experimental laser-induced CNV. METHODS: CNV was induced using laser energy to disrupt Bruch's membrane. Rats were euthanatized immediately after laser injury and at 1, 2, 3, 4, 7, 14, and 60 days. Nonlasered eyes were used as the control. Eyes were enucleated and fixed, and the posterior eye cups were fluorescently labeled with markers for nuclei (DAPI; 4',6'-diamino-2-phenylindole), endothelial cells (isolectin IB4), microglia (CD11b), and filamentous actin (phalloidin). FITC-dextran perfusion was compared with our technique. A confocal microscope was used to evaluate flatmounted specimens. Computer software generated three-dimensional reconstructions for qualitative and quantitative analysis of confocal image stacks. RESULTS: In nonlasered areas, RPE cells were visualized as a uniform hexagonal array. Immediately after laser exposure, a circular area devoid of fluorescent labeling was observed, indicating disruption of the choroid-Bruch's membrane-RPE complex. One day after laser exposure, cellular debris and fragmented nuclei were present, and an autofluorescent ring was visible at the site of Bruch's membrane disruption. The ring correlated with bubble formation and CNV induction. Three days after laser injury, phalloidin-labeled RPE cells and isolectin-labeled endothelial cells increased significantly, reflecting cell proliferation and migration. By day 4, isolectin-positive cells forming vascular tubes were visualized. The volume of CNV vessels increased exponentially during the next 3 days. By 7 days, a well-defined isolectin-labeled CNV network was present, and its volume was preserved for several weeks. CNV volumes calculated on the basis of FITC-dextran perfusion were significantly lower than volumes obtained using lectin-labeled samples. CONCLUSIONS: A novel imaging technique was developed that allows a three-dimensional reconstruction and measurement of laser-induced CNV lesions in rat choroid/RPE flatmounts. This technique provides excellent morphologic detail and facilitates the study of critical early events in CNV, including the rupture of Bruch's membrane and the formation of endothelial clusters before vessel formation. CNV complexes are labeled at an earlier stage and more reproducibly than with FITC-dextran perfusion, providing a more accurate preclinical evaluation of antiangiogenic molecules.