高スループットプロテオミクス研究のためのタンパク質の前濃縮と消化の組み合わせのための二機能モノリシックカラム

タンパク質の酵素消化は、質量分析（MS）によるタンパク質同定の重要なステップです。従来の溶液ベースのタンパク質消化法には長いインキュベーション時間が必要であり、高スループットプロテオミクス研究の制限です。最近、固相消化（たとえば、固体サポートでのトリプシン固定化）は、タンパク質消化の速度を加速し、固体支持体に酵素部分を固定して分離することによりオートディゲーションを排除するための有用な戦略となっています。モノリシックメディアは、モノリスの表面上の機能グループの高速物質移動、ほとんどの溶媒の安定性、および汎用性を含む独自の特性により、酵素の固定化に対する魅力的なサポートです。柱タンパク質消化のために固定化トリプシンモノリシック毛細血管を調製し、LC/FTICRタンデムMSを介して消化されたペプチドを分析し、MALDI-TOF-MSによるペプチド質量フィンガープリンティングを比較しました。低存在性タンパク質の消化効率をさらに向上させるために、C4官能基をモノリス表面に導入して、柱のタンパク質濃縮と消化を組み合わせました。C4を含まない固定化トリプシンモノリシック毛細血管と比較して、固定化されたトリプシン-C4モノリスは消化効率の改善を示しました。このホワイトペーパーでは、サンプル濃縮と柱消化の組み合わせによる効率を高めるメカニズムも提案しています。さらに、観察された消化ペプチド配列を比較することにより、消化と検出に対する有機溶媒の効果を調査しました。私たちのデータは、すべてのカラムが有機溶媒に対する良好な耐性を示し、少なくとも30日間再現可能な酵素活性を維持することを実証しました。

Enzymatic digestion of proteins is a key step in protein identification by mass spectrometry (MS). Traditional solution-based protein digestion methods require long incubation times and are limitations for high throughput proteomics research. Recently, solid phase digestion (e.g. trypsin immobilization on solid supports) has become a useful strategy to accelerate the speed of protein digestion and eliminate autodigestion by immobilizing and isolating the enzyme moieties on solid supports. Monolithic media is an attractive support for immobilization of enzymes due to its unique properties that include fast mass transfer, stability in most solvents, and versatility of functional groups on the surfaces of monoliths. We prepared immobilized trypsin monolithic capillaries for on-column protein digestion, analyzed the digested peptides through LC/FTICR tandem MS, and compared peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF-MS. To further improve the digestion efficiency for low abundance proteins, we introduced C4 functional groups onto the monolith surfaces to combine on-column protein enrichment and digestion. Compared with immobilized trypsin monolithic capillaries without C4, the immobilized trypsin-C4 monolith showed improved digestion efficiency. A mechanism for increased efficiency from the combination of sample enrichment and on-column digestion is also proposed in this paper. Moreover, we investigated the effects of organic solvent on digestion and detection by comparing the observed digested peptide sequences. Our data demonstrated that all columns showed good tolerance to organic solvents and maintained reproducible enzymatic activity for at least 30 days.