DNA合成に対する2 '、2'-ジフルオロデキシチチジンの作用

DNA合成に対する新しいデオキシシチジン類似体2 '、2'-ジフルオロデキシチチジン（DFDC）の作用は、精製DNAポリメラーゼを使用した細胞全体およびin vitroアッセイシステムで調査されました。ヒトリンパ芽細胞症セム細胞のDNA合成は、外因性デオキシヌクレオシドによって逆転することはできない濃度依存的にDFDCによって阻害されました。アナログは細胞DNAに組み込まれました。組み込まれたDFDC 5'-モノリン酸（DFDCMP）残基のほとんどは、ヌクレオチド結合に含まれていました。in vitro DNAプライマー伸長アッセイにより、DFDC 5'-トリリン酸（DFDCTP）が、成長しているDNA鎖のC部位に組み込むためにデオキシシチジン三リン酸と競合したことが実証されました。DFDCTPとDCTPのM13MP19 DNAのC部位への取り込みの見かけのKM値の比率は、それぞれDNAポリメラーゼアルファとイプシロンで21.8および22.9でした。DFDCTPの見かけのKI値は、DNAポリメラーゼアルファで11.2 microM、ポリメラーゼイプシロンで14.4 microMでした。DFDCMPの取り込みの後、プライマーは、重合プロセスの大規模な一時停止が観察される前に、1つのデオキシヌクレオチドによって拡張されました。これは、アラビノシルシトシン5'-トリリン酸の作用とは対照的であり、DNAポリメラーゼアルファとイプシロンの両方が取り込み部位で一時停止しました。DNAポリメラーゼイプシロンの3 '---- 5'エキソヌクレアーゼ活性は、3 '末端または内部位置でDFDCMPを含むDNAからヌクレオチドを除去することができませんでしたが、アラビノシルシトシンの単リン酸は3'-Terminusから除去されました。デオキシヌクレオチドの37％。DFDCの細胞毒性活性は、細胞DNAに組み込まれたDFDCMPの量と強く相関していました。我々の結果は、DNA代謝に対するDFDCおよびアラビノシルシトシンの分子作用の定性的および定量的な違いを示していますが、DFDCの毒性へのそのような取り込みの重要な役割と一致しています。

The action of the new deoxycytidine analogue 2',2'-difluorodeoxycytidine (dFdC) on DNA synthesis was investigated in whole cells and in vitro assay systems with purified DNA polymerases. DNA synthesis in human lymphoblastoid CEM cells was inhibited by dFdC in a concentration-dependent manner that could not be reversed by exogenous deoxynucleosides. The analogue was incorporated into cellular DNA; most of the incorporated dFdC 5'-monophosphate (dFdCMP) residues were in internucleotide linkage. In vitro DNA primer extension assays demonstrated that dFdC 5'-triphosphate (dFdCTP) competed with deoxycytidine triphosphate for incorporation into the C sites of the growing DNA strand. The ratios of the apparent Km values for the incorporation of dFdCTP and dCTP into a C site of M13mp19 DNA were 21.8 and 22.9 for DNA polymerases alpha and epsilon, respectively. The apparent Ki values of dFdCTP were 11.2 microM for DNA polymerase alpha and 14.4 microM for polymerase epsilon. After dFdCMP incorporation, the primer was extended by one deoxynucleotide before a major pause in the polymerization process was observed. This was in contrast to the action of arabinosylcytosine 5'-triphosphate, which caused both DNA polymerases alpha and epsilon to pause at the site of incorporation. The 3'----5' exonuclease activity of DNA polymerase epsilon was essentially unable to excise nucleotides from DNA containing dFdCMP at either the 3'-end or at an internal position, whereas arabinosylcytosine monophosphate was removed from the 3'-terminus at 37% the rate for deoxynucleotides. The cytotoxic activity of dFdC was strongly correlated with the amount of dFdCMP incorporated into cellular DNA. Our results demonstrate qualitative and quantitative differences in the molecular actions of dFdC and arabinosylcytosine on DNA metabolism, but are consistent with an important role for such incorporation in the toxicity of dFdC.