組換えヒトヒアルロニダーゼヒアル-1：昆虫細胞と大腸菌の発現システムとしての大腸菌および低分子量阻害剤の同定

ヒトヒアルロニダーゼヒアル-1は、6つのヒトヒアルロニダーゼサブタイプの1つであり、体細胞組織の細胞外マトリックスに存在するヒアルロン酸を優先的に分解します。多くの悪性腫瘍でHyal-1発現の調節が観察されています。しかし、疾患の進行におけるその役割は、酵素特性に関する情報が限られているだけでなく、特定の阻害剤の欠如により、物議を醸しています。したがって、原核生物および昆虫細胞系でヒトHyal-1を発現させて、精製された酵素を大量に生成しました。大腸菌では、HYAL-1が包含体を形成し、金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製後にin vitroで再溶けました。しかし、酵素は非常に低い折りたたみ収率（0.5％）で生成され、低い特異的活性（0.1 U/mg）を示しました。あるいは、Hyal-1を安定してトランスフェクトされたショウジョウバエSchneider-2（DS-2）細胞の媒体に分泌されました。いくつかの精製ステップの後、8.6 U/mgの特定の活性を持つ非常に純粋な酵素（血漿からのヒトHyal-1の報告された活性と一致）が得られました。両方のHyal-1酵素は、pH 3.5-4.0で最大活性を持つヒト血漿のヒアルロニダーゼと同様のpHプロファイルを示しました。DS-2細胞で発現するヒアル-1の脱グリコシル化は、比色ヒアルロニダーゼ活性アッセイによって決定される酵素活性の減少をもたらしました。DS-2細胞からの精製されたHyal-1を、新しいアスコルビン酸誘導体の阻害活性の調査に使用しました。このシリーズ内で、L-アスコルビ酸トリデカン酸は、グリシルリジン酸に匹敵する50 +/- 4マイクロームのIC（50）を備えた最も強力な阻害剤として同定されました。

The human hyaluronidase Hyal-1, one of six human hyaluronidase subtypes, preferentially degrades hyaluronic acid present in the extracellular matrix of somatic tissues. Modulations of Hyal-1 expression have been observed in a number of malignant tumors. However, its role in disease progression is discussed controversially due to limited information on enzyme properties as well as the lack of specific inhibitors. Therefore, we expressed human Hyal-1 in a prokaryotic and in an insect cell system to produce larger amounts of the purified enzyme. In Escherichia coli, Hyal-1 formed inclusion bodies and was refolded in vitro after purification by metal ion affinity chromatography. However, the enzyme was produced with extremely low folding yields (0.5%) and exhibited a low specific activity (0.1 U/mg). Alternatively, Hyal-1 was secreted into the medium of stably transfected Drosophila Schneider-2 (DS-2) cells. After several purification steps, highly pure enzyme with a specific activity of 8.6 U/mg (consistent with the reported activity of human Hyal-1 from plasma) was obtained. Both Hyal-1 enzymes showed pH profiles similar to the hyaluronidase of human plasma with an activity maximum at pH 3.5-4.0. Deglycosylation of Hyal-1, expressed in DS-2 cells, resulted in a decrease in the enzymatic activity determined by a colorimetric hyaluronidase activity assay. Purified Hyal-1 from DS-2 cells was used for the investigation of the inhibitory activity of new ascorbic acid derivatives. Within this series, l-ascorbic acid tridecanoate was identified as the most potent inhibitor with an IC(50) of 50 +/- 4 microM comparable with glycyrrhizic acid.