蛍光ピリミジンリボヌクレオチド：合成、酵素的取り込み、および利用

微小環境の変化に反応する蛍光核酸塩基類似体は、RNA構造、ダイナミクス、および認識の研究に役立ちます。最も一般的に使用される蛍光リボヌクレオシドは、2-アミノプリンであり、非常に反応性の高いプリン類似体です。しかし、反応性の高い等鉄蛍光ピリミジン類似体はまれです。ピリミジンコアの5位置での5メンバーの芳香族環状環状化は最近、目に見える範囲の放出を伴う応答性のある蛍光ヌクレオシド類似体のファミリーを提供することがわかっています。RNAリガンド相互作用を研究するためのこの発色団の潜在的な有用性を調査するには、効率的な取り込み方法が必要です。ここでは、フラン含有リボヌクレオシドとその三リン酸の合成と、その基本的な光物理特性について説明します。T7 RNAポリメラーゼは、in vitro転写反応の基質としてこの蛍光リボヌクレオシド三リン酸を受け入れ、RNAオリゴヌクレオチドに非常に効率的に組み込まれ、蛍光構造を生成することを実証します。さらに、この三リン酸を利用して、潜在的な治療効用のRNA構築物である蛍光細菌Aサイトの酵素調製を利用します。このRNA標的のアミノグリコシド抗生物質、その同族リガンドへの結合は、蛍光分光法によって効果的に監視できることを示しています。これらの観察結果は重要であり、等状の放射性U誘導体は希少であり、些細な合成とフラン含有U三リン酸の効果的な酵素的取り込みにより、生物物理学界がアクセスできるようになります。

Fluorescent nucleobase analogues that respond to changes in their microenvironment are valuable for studying RNA structure, dynamics, and recognition. The most commonly used fluorescent ribonucleoside is 2-aminopurine, a highly responsive purine analogue. Responsive isosteric fluorescent pyrimidine analogues are, however, rare. Appending five-membered aromatic heterocycles at the 5-position on a pyrimidine core has recently been found to provide a family of responsive fluorescent nucleoside analogues with emission in the visible range. To explore the potential utility of this chromophore for studying RNA-ligand interactions, an efficient incorporation method is necessary. Here we describe the synthesis of the furan-containing ribonucleoside and its triphosphate, as well as their basic photophysical characteristics. We demonstrate that T7 RNA polymerase accepts this fluorescent ribonucleoside triphosphate as a substrate in in vitro transcription reactions and very efficiently incorporates it into RNA oligonucleotides, generating fluorescent constructs. Furthermore, we utilize this triphosphate for the enzymatic preparation of a fluorescent bacterial A-site, an RNA construct of potential therapeutic utility. We show that the binding of this RNA target to aminoglycoside antibiotics, its cognate ligands, can be effectively monitored by fluorescence spectroscopy. These observations are significant since isosteric emissive U derivatives are scarce and the trivial synthesis and effective enzymatic incorporation of the furan-containing U triphosphate make it accessible to the biophysical community.