C/EBPBETAによるDNA結合および転写活性化に対するリン酸化とS-S結合誘導二量体化の効果

CCAATエンハンサー結合タンパク質ベータ（C/EBPBETA）は、脂肪細胞の分化を引き起こすカスケードで重要な役割を果たします。C/EBPBETAは、脂肪細胞表現型を生じさせる遺伝子の転写活性化因子であるC/EBPALPHAおよびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマの転写を活性化します。MAPKによるTHR（188）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼベータ（GSK3BETA）によるThr（188）およびSer（184）またはThr（179）のC/EBPBETA/肝活性化タンパク質（LAP）の連続リン酸化は、DNA結合活性の獲得と転写活性化の獲得に必要です。。C/EBPBETA/LAPのリン酸化と二量体化がこれらの活性をどのように変化させるかを調査するために、野生型（WT）および変異RC/EBPBETAを調製および精製して、無細胞系のDNA結合と転写を評価しました。in vitroでMAPKおよびGSK3BETAによってリン酸化されたRC/EBPBETA/LAPは、DNA結合活性の100倍以上の増加をもたらしました。Gluへのリン酸化の変異は、DNA結合活性を増加させました。3T3-L1前脂肪細胞とRC/EBPBETA/LAPからの核抽出物を含む無細胞転写系を使用して、WT C/EBPALPHA、422/AP2、および422/AP2、および422、および422/AP2、およびrc/ebpbeta/Lap（MAPKおよびGSK3BETA）のみの二重リン酸化RC/EBPBETA/LAPのみを使用しています。SCD1プロモーター。二重リン酸化WT RC/EBPBETA/LAPの酸化による二量体化DNA結合は増加しましたが、リン酸化されていないWT RC/EBPBETA/LAPにはDNA結合活性がありませんでした。ロイシンジッパーおよびCYS（143）に隣接するC末端Cys（296）の変異（296）は、DNA結合ドメインのすぐ上流でリン酸化、酸化、および二量体依存性DNA結合活性を排除しましたが、CYSの変異（201）基本的なDNA結合ドメインは、DNA結合にほとんど影響を与えませんでした。これらの発見は、C/EBPBETA/LAPの二重リン酸化が、S-S結合形成と二量体化を促進する立体構造の変化を引き起こし、基本領域をC/EBP調節要素にアクセスできるようにすることを示しています。

CCAAT enhancer binding protein beta (C/EBPbeta) plays an essential role in the cascade that triggers adipocyte differentiation. C/EBPbeta activates transcription of C/EBPalpha and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, transcriptional activators of genes that give rise to the adipocyte phenotype. Sequential phosphorylation of C/EBPbeta/liver activating protein (LAP) on Thr(188) by MAPK and on Ser(184) or Thr(179) by glycogen synthase kinase beta (GSK3beta) is required for acquisition of DNA binding activity and transcriptional activation. To investigate how phosphorylation and dimerization of C/EBPbeta/LAP alter these activities, wild-type (Wt) and mutant rC/EBPbetas were prepared and purified to assess DNA binding and transcription in cell-free systems. rC/EBPbeta/LAP, phosphorylated by MAPK and GSK3beta in vitro, produced a >100-fold increase in DNA binding activity. Mutation of the phosphorylation to Glu increased DNA binding activity. Using a cell-free transcription system with nuclear extract from 3T3-L1 preadipocytes and rC/EBPbeta/LAP, only doubly phosphorylated rC/EBPbeta/LAP (by MAPK and GSK3beta) activated transcription driven by Wt C/EBPalpha, 422/aP2, and SCD1 promoters. Oxidation-induced dimerization of doubly phosphorylated Wt rC/EBPbeta/LAP increased DNA binding, whereas unphosphorylated Wt rC/EBPbeta/LAP lacked DNA binding activity. Mutation of the C-terminal Cys(296) adjacent to the leucine zipper and Cys(143) just upstream of the DNA binding domain eliminated phosphorylation-, oxidation-, and dimerization-dependent DNA binding activity, whereas mutation of Cys(201) within the basic DNA binding domain had little effect on DNA binding. These findings indicate that dual phosphorylation of C/EBPbeta/LAP caused a conformational change that facilitates S-S bond formation and dimerization, rendering the basic region accessible to the C/EBP regulatory element.