ペプチドの液体クロマトグラフィマス分光測定分析における回復と再現性の改善

ピーク領域の再現性が低いことは、質量分析（Nanolc-MS）とオンラインで結合したナノリキッドクロマトグラフィーによるペプチド分析で頻繁に発生する問題です。その結果、観察された変動性を何らかの形で修正できる限り、定量分析は深刻に妨げられます。現在、この目的のために、ラベル付け手法または内部標準の追加がしばしば適用されます。ただし、これらの手順は精巧でエラーが発生しやすく、複雑なサンプルがさらに複雑になる可能性があります。さらに、再現性が低い場合はいつでも、変化する回復から生じる場合は、定量化だけでなく、感度も影響を受けます。Nanolc-MS分析におけるタンパク質分解ペプチドのモデルセット（すなわち、シトクロムCトレイシック消化）のモデルセットのクロマトグラフィーピーク領域の再現性に影響を与えるパラメーターを研究しました。再現性の問題は、主にサンプルバイアルからのペプチドの回収不良によるものであることが実証されています。問題は、ペプチドの溶解度を向上させるためにサンプルバイアルに有機修飾子を添加することにより主に解決されますが、逆相材料に対する親和性の低下のためにペプチドを失わないように注意する必要があります。この目的のためにジメチルスルホキシド（DMSO）を適用する場合、良好な結果が得られます。DMSOを適用すると、再現性が向上し、検出限界（LOD）が減少します。最も疎水性のペプチドの場合、少なくとも数桁のLODの増加が得られます。0.1％ギ酸（FA）を含む水性サンプルでは、​​ペプチドの100-200 FMOLを検出することができますが、5％FAおよび25％DMSO（10ミクロール注入）を含むサンプルで+/- 10 FMOLを検出できます。。

Poor repeatability of peak areas is a problem frequently encountered in peptide analysis with nanoLiquid Chromatography coupled on-line with Mass Spectrometry (nanoLC-MS). As a result, quantitative analysis will be seriously hampered unless the observed variability can be corrected in some way. Currently, labeling techniques or addition of internal standards are often applied for this purpose. However, these procedures are elaborate and error-prone and may render complex samples even more complex. Moreover, whenever poor repeatability results from variable recovery, not just quantification, but also sensitivity is affected. We have studied the parameters influencing the repeatability of chromatographic peak areas for a model set of proteolytic peptides (i.e., a cytochrome c tryptic digest) in nanoLC-MS analysis. It is demonstrated that repeatability issues are mainly due to poor recovery of peptides from the sample vial. Problems are largely resolved by addition of an organic modifier to the sample vial to improve solubility of the peptides, but care needs to be taken not to lose peptides due to reduced affinity for reversed-phase materials. Good results are obtained when applying dimethylsulfoxide (DMSO) for this purpose. When applying DMSO, repeatability increases, and the limit of detection (LOD) decreases. For the most hydrophobic peptides, a gain in LOD of at least an order of magnitude is obtained. In an aqueous sample containing 0.1% formic acid (FA), it is possible to detect 100-200 fmol of peptide, whereas +/-10 fmol can be detected in a sample containing 5% FA and 25% DMSO (10 microL injections).