新鮮、凍結、凍結乾燥塊茎および根組織からのRNAの抽出

高レベルの澱粉とフェノリックを含む新鮮な、凍結型、凍結乾燥植物貯蔵組織から転写的に有能なRNAを分離する方法について説明します。このプロトコルは、グアニジウム塩の使用を回避します。グアニジウム塩は、しばしば高澱粉含有組織の抽出中に粘性ゲルの形成につながり、代わりに高濃度のNaCl、Na2SO3、およびドデシル硫酸ナトリウムと組み合わせてホウ酸トリス緩衝液を使用します。抽出媒体で。RNAは、ジャガイモ塊茎の新鮮、冷凍、凍結乾燥組織、サツマイモ、大根、カブ、および生ingerの根茎の貯蔵根から抽出されました。ジャガイモの塊茎からのRNAの収量は、凍結および凍結乾燥サンプルからそれぞれ281ミクログGの新鮮な重量（-1）および1584マイクログG乾燥重量（-1）を平均しました。ジャガイモRNA抽出物のA260/A230比は2.2以上であり、ポリフェノールと炭水化物による最小限の汚染を示しています。同様に、A260/A280比は1.9を超え、塊茎タンパク質によるRNAの最小限の汚染を示しました。他の植物種からの抽出物のA260/A280比は、ジャガイモの抽出物よりもやや低かったが（新鮮で凍結乾燥したサンプルの場合、それぞれ平均= 1.56および1.80）、A260/A230比は2.0を超え、RNAは新鮮から抽出され、アガロース - ホルムアルデヒドゲル電気泳動を変性させることによって示されるように、すべての種の凍結乾燥サンプルは無傷でした。このプロトコルは、5種すべてからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を含む下流の分子用途に適したRNAを生成しました。また、冷たいアセトンでの抽出を含むプロトコルの単純な変更により、6年間保存された凍結乾燥ポテト塊茎組織から転写有能なRNAも回収されました。したがって、凍結乾燥を使用して、遺伝子発現に関する研究のために、澱粉およびフェノール性を含む植物組織のRNAを保存することができます。

A method for isolating transcriptionally competent RNA from fresh, frozen, and lyophilized plant storage tissues containing high levels of starch and phenolics is described. The protocol avoids the use of guanidium salts, which often lead to the formation of a viscous gel during extraction of high starch-containing tissues, and instead uses a borate-Tris buffer in combination with high concentrations of NaCl, Na2SO3, and sodium dodecyl sulfate in the extraction medium. RNA was extracted from fresh, frozen, and lyophilized tissues of potato tubers, storage roots of sweet potato, radish, and turnip, and rhizomes of ginger. The yield of RNA from potato tubers averaged 281 microg g fresh weight(-1) and 1584 microg g dry weight(-1) from frozen and lyophilized samples, respectively. A260/A230 ratios of potato RNA extracts were 2.2 or greater, indicating minimal contamination by polyphenols and carbohydrates. Similarly, A260/A280 ratios exceeded 1.9, demonstrating minimal contamination of the RNA by tuber protein. While A260/A280 ratios of extracts from the other plant species were somewhat lower than those for potato (average = 1.56 and 1.80 for fresh and lyophilized samples, respectively), A260/A230 ratios averaged more than 2.0, and the RNA extracted from fresh and lyophilized samples of all species was intact, as demonstrated by denaturing agarose-formaldehyde gel electrophoresis. The protocol yielded RNA suitable for downstream molecular applications involving reverse transcription-polymerase chain reaction from all five species. Transcriptionally competent RNA was also recovered from lyophilized potato tuber tissue stored for 6 years (ambient temperature) by a simple modification to the protocol involving extraction in cold acetone. Lyophilization can thus be used to preserve RNA in high starch- and phenolic-containing plant tissues for studies on gene expression.