正常なヒト肝臓からの分離肝脂肪細胞とクッファー細胞：一次培養における形態学的および機能的特性

げっ歯類から肝脂肪細胞（伊藤、星、または脂肪貯蔵細胞）を分離するための技術の開発は、肝臓のビタミンA貯蔵と線維形成における役割を定義するのに役立っています。この研究では、正常なヒト肝臓のウェッジセクションから脂肪細胞とクッファー細胞の精製のための方法を開発し、一次培養におけるその特性を調べました。ドナー肝臓のセクション（400〜600 gm）は収穫されましたが、移植に使用されていませんでしたが、ウィスコンシン大学溶液でその場で灌流し、48時間以内に脂肪細胞の分離に使用しました。細胞は、L-15塩、プロナゼ、コラゲナーゼを備えたいくつかの大きな血管を介したウェッジのカテーテル灌流、続いてLarex密度勾配遠心分離によって分離されました。脂肪細胞を、コーティングされていないプラスチックまたは基底膜様ゲルのいずれかに播種しました。脂肪細胞およびクッファー細胞の収量は、肝臓1グラムあたりの2.3 +/- 0.6 x 10（5）および8.6 +/- 1.4 x 10（5）細胞でした（n = 5）。脂肪細胞の純度は、ビタミンAの自己蛍光で評価されたように91％であり、クッパー細胞純度は蛍光ブドウ球菌の摂取によって決定されたように83％でした。プラスチックで培養された脂肪細胞は48〜72時間以内に広がり、同等のラット細胞よりもわずかに不均一なレチノイド液滴サイズを示します。地下層のゲルでは、細胞は凝集したままで、時折の紡錘形の拡張機能を備えています。プラスチック上の脂肪細胞は、免疫細胞化学によるコラーゲンIおよびIII、コラーゲンIVおよびラミニン、およびRNase保護によるI、IIIおよびIVプロコラゲンメッセンジャーRNAのタイプを発現しました。それぞれノーザンブロットとポリメラーゼ連鎖反応。7日間の脂肪細胞の透過型電子顕微鏡では、顕著な粗い小胞体および収縮フィラメントが示されました。走査型電子顕微鏡では、細胞膜の下に核周囲液滴がある滑らかな細胞表面が明らかになりました。プラスチック上の一次培養（7日以上）が継続して、細胞は「活性化」（すなわち、広がりの増加とレチノイド液滴の減少）に見え、核自己放射線撮影と[3H]チミジンの取り込みによって評価されたように増殖し始めました。初期の初代培養で電子顕微鏡を走査することで観察されたKupffer細胞は、顕著な膜の波紋とラメリポディアを示しました。要約すると、ヒト脂肪細胞とクッファー細胞の分離と一次培養のための再現可能な方法を確立しました。

The development of techniques for isolating hepatic lipocytes (Ito, stellate or fat-storing cells) from rodents has been instrumental in defining their role in hepatic vitamin A storage and fibrogenesis. In this study, we developed a method for the purification of lipocytes and Kupffer cell from wedge sections of normal human liver and examined their properties in primary culture. Sections of donor liver (400 to 600 gm) harvested but not used for transplantation were perfused in situ with University of Wisconsin solution and used for lipocyte isolation within 48 hr. Cells were isolated by catheter perfusion of the wedge through several large vessels with L-15 salts, Pronase and collagenase, followed by Larex density gradient centrifugation. Lipocytes were plated on either uncoated plastic or a basement membrane-like gel. Lipocyte and Kupffer cell yields were 2.3 +/- 0.6 x 10(5) and 8.6 +/- 1.4 x 10(5) cells, respectively, per gram of liver (n = 5). Lipocyte purity was 91% as assessed by vitamin A autofluorescence, and Kupffer cell purity was 83% as determined by uptake of fluorescinated staphylococci. Lipocytes cultured on the plastic spread within 48 to 72 hr, displaying slightly more heterogeneous retinoid droplet size than comparable rat cells; on a basement-membrane gel, the cells remained aggregated and spherical with occasional spindlelike extensions. Lipocytes on plastic expressed procollagens I and III, collagen IV and laminin by immunocytochemistry, and types I, III and IV procollagen messenger RNAs by RNAse protection. Northern blot and polymerase chain reaction, respectively. Transmission electron microscopy of lipocytes at 7 days demonstrated a prominent rough endoplasmic reticulum and contractile filaments. Scanning electron microscopy revealed a smooth cell surface with perinuclear droplets beneath the cell membrane. With continued primary culture on plastic (more than 7 days), cells appeared "activated" (i.e., increased spreading and diminished retinoid droplets) and began proliferating as assessed by nuclear autoradiography and [3H]thymidine incorporation. Kupffer cells observed by scanning electron microscopy in early primary culture displayed prominent membrane ruffling and lamellipodia. In summary, we have established a reproducible method for the isolation and primary culture of human lipocytes and Kupffer cells.