HOMO-FRET分光法と顕微鏡による生細胞における膜タンパク質のオリゴマー化状態の列挙：理論と応用

タンパク質間相互作用は、生物学的シグナル伝達ネットワークで極めて重要な役割を果たします。オリゴマー化状態を直接評価できる実験と、生物環境における生物学的高分子のオリゴマー化度を直接評価できる実験を実施することが非常に望ましいです。HOMO-FRETは、ナノメートルスケールでのフルオロフォアのように相互作用する間の分離の逆の6番目の力に依存しているため、タンパク質オリゴマー化に敏感です。HOMO-FRETは通常、定常状態または時間分解蛍光異方性測定によって検出されます。ここでは、フルオロフォアの標識（または光場付け）の関数として定常状態の蛍光異方性によって測定されたホモツァーファーの程度の検査が、自己分類タンパク質のオリゴマー化状態に関する貴重な情報を提供することを理論とシミュレーションによって示します。モノマーのランダム分布、オリゴマーの希釈溶液、およびオリゴマーの濃縮溶液を調べます。この理論は、膜のバンド3タンパク質二量体、「ラフト」のGPI結合タンパク質トリマーに関する文献データに適用され、細胞膜のGFPタグ付き表皮成長因子受容体をクラスター化して、分析的アプローチの一般的な有用性と適用性を説明します。

Protein-protein interactions play a pivotal role in biological signaling networks. It is highly desirable to perform experiments that can directly assess the oligomerization state and degree of oligomerization of biological macromolecules in their native environment. Homo-FRET depends on the inverse sixth power of separation between interacting like fluorophores on the nanometer scale and is therefore sensitive to protein oligomerization. Homo-FRET is normally detected by steady-state or time-resolved fluorescence anisotropy measurements. Here we show by theory and simulation that an examination of the extent of homotransfer as measured by steady-state fluorescence anisotropy as a function of fluorophore labeling (or photodepletion) gives valuable information on the oligomerization state of self-associating proteins. We examine random distributions of monomers, dilute solutions of oligomers, and concentrated solutions of oligomers. The theory is applied to literature data on band 3 protein dimers in membranes, GPI-linked protein trimers in "rafts," and clustered GFP-tagged epidermal growth factor receptors in cell membranes to illustrate the general utility and applicability of our analytical approach.