e coli開始因子IF2の上位拡張と迅速な精製

大量のE COLI開始因子IF2の生産のために、改善された過剰発現システムを構築しました。遺伝子INFBは、熱誘導性暴走プラスミドPCP40 [1]にクローニングされ、その後E COLI株C600 [PCI857]に変換されました。このシステムでは、INFBの発現は強力なプロモーターLambda PLの制御下にあり、細胞は熱感受性Lambda CIリプレッサーを含むプラスミドPCI857を運びます。IF2の過剰発現は、野生型細胞での発現の約30倍高く、42度Cで誘導され、37度Cで2時間続きます。Q-セファロースHP、Monoq、およびMonosのイオン交換液体クロマトグラフィーで構成されるステップFPLCプロークア。約8時間で、10 gの過剰産生細胞から5 mgの純粋なIF2および活性IF2を得ることができます。これは、培地1リットルあたり5 mgのIF2に相当します。精製は西部の免疫ブロッティングによって監視され、精製因子の活性は、GTPおよびPoly（a、u、g）の存在下で、イニシエーターFMET-TRNA（MET）Fから70Sリボソームの結合の刺激を測定することによりテストされました。メッセンジャーRNA。以前の方法と比較して、浄化手順は、流量が比較的低いDEAEセルロースやホスホセルロースなどの材料の使用を回避します。Q-セファロースHPのより高い流量容量に加えて、この新しいマトリックスにはS30上清をロードできます（250ワードで切り捨てられた抽象）

For the production of large quantities of E coli initiation factor IF2 we have constructed an improved overexpression system. The gene infB was cloned into the thermo-inducible runaway plasmid pCP40 [1] and subsequently transformed into the E coli strain C600[pcI857]. In this system the expression of infB is under the control of the strong promoter lambda PL and the cells carry the plasmid pcI857, which contains a thermosensible lambda cI repressor. Overexpression of IF2, which is approximately 30 times higher than the expression in wild-type-cells, is induced at 42 degrees C and continues for 2 h at 37 degrees C. From these cells pure and active IF2 was obtained using a novel 3-step FPLC-procedure consisting of ion-exchange liquid chromatography on Q-sepharose HP, MonoQ and MonoS. In approximately 8 h, 5 mg of pure and active IF2 can be obtained from 10 g overproducing cells. This corresponds to 5 mg of IF2 per litre of medium. The purification was monitored by Western immunoblotting and the activity of the purified factor was tested by measuring the stimulation of binding of the initiator fMet-tRNA(Met)f to 70S ribosomes in the presence of GTP and poly(A,U,G) as messenger RNA. Compared with previous methods our purification procedure avoids the use of materials such as DEAE-cellulose and phosphocellulose which have relatively poor flow rates. In addition to the higher flow capacity of Q-sepharose HP, this new matrix can be loaded with an S30 supernatant.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)