tRNA-shRNA発現コンストラクトの最適化と特性評価

Poliiiベースの転写システムの使用による短いヘアピンRNAの発現は、哺乳類細胞でRNAiをトリガーするための効果的なメカニズムであることが証明されています。この目的で最も人気のあるプロモーターは、U6およびH1プロモーターが、定義された開始信号と停止信号を備えたSHRNAの発現のために簡単に操作できるためです。多重化（複数のターゲットに対するsiRNAの使用）は、アプリケーションでの耐性ウイルスの出現を抑制する可能性を高めるため、HIV感染の治療のために多くの研究所によって開発されている戦略の1つです。これに関連して、U6およびH1以外の代替小型Poliiiプロモーターの開発が役立ちます。TRNA（Lys3） - shRNAキメラ発現カセットについて説明します。これは、U6で発現したshRNAに匹敵する有効性と鎖選択性を備えたsiRNAを生成し、内因性3 'TRNaseによる処理と一致していることを示します。さらに、我々の観察結果は、細胞内の内因性RNAi経路の成分の競争に関連する毒性を最小限に抑えるために、段階的な反応の可能性を秘めた効果的なtRNA-shRNAを表現するための一般的なガイドラインを示唆しています。

Expression of short hairpin RNAs via the use of PolIII-based transcription systems has proven to be an effective mechanism for triggering RNAi in mammalian cells. The most popular promoters for this purpose are the U6 and H1 promoters since they are easily manipulated for expression of shRNAs with defined start and stop signals. Multiplexing (the use of siRNAs against multiple targets) is one strategy that is being developed by a number of laboratories for the treatment of HIV infection since it increases the likelihood of suppressing the emergence of resistant virus in applications. In this context, the development of alternative small PolIII promoters other than U6 and H1 would be useful. We describe tRNA(Lys3)-shRNA chimeric expression cassettes which produce siRNAs with comparable efficacy and strand selectivity to U6-expressed shRNAs, and show that their activity is consistent with processing by endogenous 3' tRNAse. In addition, our observations suggest general guidelines for expressing effective tRNA-shRNAs with the potential for graded response, to minimize toxicities associated with competition for components of the endogenous RNAi pathway in cells.