細菌のアルキルヒドロペルオキシド還元酵素システムのAhpFおよびAhpCにおけるシステイン反応性およびチオール-ジスルフィド交換経路

Salmonella TyphimuriumのAHPCとAHPFは、一連の電子転移を受けて、ヒドロペルオキシド基質のピリジンヌクレオチド依存性還元を触媒します。このアルキルヒドロペルオキシダーゼ系の過酸化物還元（ペルオキシレドキシン）成分であるAHPCは、細菌における内因性過酸化水素の重要なスカベンジャーであり、反応性の過酸化システイン、Cys46、および2番目のシステイン、Cys165を介して作用します。つなぐ。別々のジスルフィド還元酵素タンパク質であるAHPFは、密接に結合したフラビンと2つのジスルフィド中心、Cys345-Cys348およびCys129-Cys132を介してAHPCに移動し、推定上の大きなドメインの動きを通じて、NADHから電子を介してすべての触媒サイクルを再生します。両方のタンパク質におけるシステイン反応性とドメイン間相互作用を評価するために、両方のタンパク質の包括的な単一システイン変異体（システインをセリンに置き換える）を調製しました。5,5-ジチオビス（2-ニトロベンゾ酸）（DTNB）およびAHPFの複数の変異体とのAHPC反応性に基づいて、AHPFのN末端ドメインにおけるCys129のチオレートは、AHPC内のサブユニットジスルフィド結合のCys165に対する攻撃を開始します。タンパク質間の移動。AHPFのCys348は、N末端ジスルフィド結合のCys129硫黄を攻撃する求核剤としても特定されており、これら2つの酸化還元中心間の電子移動を開始します。これらの調査結果は、AHPFのモジュラーアーキテクチャと機能に対するドメイン回転の必要性をサポートし、AHPCの還元的再活性化におけるCys165の重要性を強調しています。さらに、2つの新しいコンストラクトが生成されました。AHPF-AHPC複合体とAHPFの「ねじれた」形式で、酸化還元中心が触媒中間体を模倣する安定したジスルフィド結合によって一緒にロックされます。

AhpC and AhpF from Salmonella typhimurium undergo a series of electron transfers to catalyze the pyridine nucleotide-dependent reduction of hydroperoxide substrates. AhpC, the peroxide-reducing (peroxiredoxin) component of this alkyl hydroperoxidase system, is an important scavenger of endogenous hydrogen peroxide in bacteria and acts through a reactive, peroxidatic cysteine, Cys46, and a second cysteine, Cys165, that forms an active site disulfide bond. AhpF, a separate disulfide reductase protein, regenerates AhpC every catalytic cycle via electrons from NADH which are transferred to AhpC through a tightly bound flavin and two disulfide centers, Cys345-Cys348 and Cys129-Cys132, through putative large domain movements. In order to assess cysteine reactivity and interdomain interactions in both proteins, a comprehensive set of single and double cysteine mutants (replacing cysteine with serine) of both proteins were prepared. Based on 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) and AhpC reactivity with multiple mutants of AhpF, the thiolate of Cys129 in the N-terminal domain of AhpF initiates attack on Cys165 of the intersubunit disulfide bond within AhpC for electron transfer between proteins. Cys348 of AhpF has also been identified as the nucleophile attacking the Cys129 sulfur of the N-terminal disulfide bond to initiate electron transfer between these two redox centers. These findings support the modular architecture of AhpF and its need for domain rotations for function, and emphasize the importance of Cys165 in the reductive reactivation of AhpC. In addition, two new constructs have been generated, an AhpF-AhpC complex and a "twisted" form of AhpF, in which redox centers are locked together by stable disulfide bonds which mimic catalytic intermediates.