PCR駆動型のオーバーラップ拡張による遺伝子スプライシングと突然変異誘発

PCRによる重複遺伝子セグメントの拡張は、部位指向の突然変異誘発と遺伝子スプライシングのためのシンプルで多用途の手法です。初期のPCRは、重複する遺伝子セグメントを生成し、その後、別のPCRのテンプレートDNAとして使用してフルレングス積を作成します。内部プライマーは、中間セグメントに重複する補完的な3 '端を生成し、部位指向の変異誘発、または遺伝子スプライシングのヌクレオチド置換、挿入または削除を導入し、隣接する遺伝子セグメントの接合部で見つかったヌクレオチドをコードします。これらの中間製品の重複鎖は、その後のPCRでこの3 '領域でハイブリダイズし、拡張され、クローン目的のための発現ベクターに製品を挿入するための制限酵素部位を含む隣接プライマーによって増幅されます。この方法による変異体またはキメラ遺伝子の非常に効率的な生成は、約1週間で標準的な実験室の試薬で簡単に達成できます。

Extension of overlapping gene segments by PCR is a simple, versatile technique for site-directed mutagenesis and gene splicing. Initial PCRs generate overlapping gene segments that are then used as template DNA for another PCR to create a full-length product. Internal primers generate overlapping, complementary 3' ends on the intermediate segments and introduce nucleotide substitutions, insertions or deletions for site-directed mutagenesis, or for gene splicing, encode the nucleotides found at the junction of adjoining gene segments. Overlapping strands of these intermediate products hybridize at this 3' region in a subsequent PCR and are extended to generate the full-length product amplified by flanking primers that can include restriction enzyme sites for inserting the product into an expression vector for cloning purposes. The highly efficient generation of mutant or chimeric genes by this method can easily be accomplished with standard laboratory reagents in approximately 1 week.