原発性および培養慢性骨髄性白血病幹細胞におけるBCR-ABL遺伝子の不安定性

背景：イマチニブメシル酸治療は、慢性骨髄性白血病（CML）の患者の過半数で寛解を引き起こしますが、再発は増加する問題です。イマチニブ耐性白血病細胞は、イマチニブなどのBCR-ABLターゲット剤にさらされる前でさえBCR-ABL遺伝子変異を獲得するCML幹細胞から出現すると仮定しました。 方法：系統陰性（すなわち、未熟）CD34+ CD38- CML幹細胞濃縮集団は、蛍光活性化細胞選別により慢性相CMLサンプルの5人の患者から分離されました。BCR-ABL遺伝子変異を特定するために、精製CML幹細胞から調製された補完DNA（cDNA）を、16キナーゼドメイン変異に対応するプライマーを使用して対立遺伝子特異的増幅を受けました。また、3〜5週間の培養後に生成された、新鮮に孤立したCML幹細胞とその子孫から調製されたBCR-ABL cDNAをクローン化し、直接配列決定しました。 結果：新たに分離されたCML幹細胞濃縮集団からのcDNA製剤の20％-33％で、対立遺伝子特異的増幅と直接シーケンス法は、BCR-ABLキナーゼドメインに対応するシーケンスの変異を明らかにしました。同様のタイプの原始正常細胞から得られたC-ABLキナーゼドメインをコードするcDNA配列では、変異は観察されませんでした。培養CML幹細胞の子孫では、70以上の異なるBCR-ABL変異（Frameshift変異と早期停止コドンを含む）が確認されました。培養細胞に由来する個々のクローンの分析により、新しいBCR-ABL変異が産生されたことが示されました。 結論：一次CML幹細胞は、in vivoとin vitroの両方でBCR-ABL融合遺伝子の不安定性を示します。したがって、患者は、BCR-ABLターゲット療法の開始前にBCR-ABLキナーゼ変異を伴う白血病幹細胞を持っている可能性があり、これらの薬剤に対する耐性を発症する傾向があるでしょう。

BACKGROUND: Imatinib mesylate treatment causes remissions in a majority of patients with chronic myeloid leukemia (CML), but relapses are an increasing problem. We hypothesized that imatinib-resistant leukemic cells emerge from CML stem cells that acquire BCR-ABL gene mutations even before exposure to BCR-ABL-targeted agents such as imatinib. METHODS: Lineage-negative (i.e., immature) CD34+ CD38- CML stem cell-enriched populations were isolated from five patients with chronic phase CML samples by fluorescence-activated cell sorting. To identify BCR-ABL gene mutations, complementary DNAs (cDNAs) prepared from purified CML stem cells were subjected to allele-specific amplification using primers corresponding to 16 kinase domain mutations, with normal bone marrow cells serving as negative controls. We also cloned and directly sequenced BCR-ABL cDNAs prepared from freshly isolated CML stem cells and from their progeny generated after 3-5 weeks of culture. RESULTS: In 20%-33% of cDNA preparations from freshly isolated CML stem cell-enriched populations, both allele-specific amplification and direct sequencing methods revealed mutations in sequences corresponding to the BCR-ABL kinase domain. Mutations were not observed in cDNA sequences encoding the c-ABL kinase domain that were obtained from similar types of primitive normal cells. More than 70 different BCR-ABL mutations (including frameshift mutations and premature stop codons) were identified in the progeny of cultured CML stem cells. Analysis of individual clones derived from the cultured cells demonstrated that new BCR-ABL mutations were produced. CONCLUSIONS: Primary CML stem cells display instability of the BCR-ABL fusion gene both in vivo and in vitro. Thus, patients may possess leukemic stem cells with BCR-ABL kinase mutations before initiation of BCR-ABL-targeted therapies and would likely be predisposed to develop resistance to these agents.