PCRおよび変性勾配ゲル電気泳動を使用した変異の分析

変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）は、一次配列に基づいてDNA分子を分離します。適切な条件下では、すべてのベースペア（BP）の置換、フレームシフト、および約10 bp未満の削除は、DGGEを使用して野生型シーケンスから解決できます。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ゲノムの特定の領域の簡単な増幅を可能にします。PCRとDGGEを以下に組み合わせました。（i）X連鎖ヒトアンドロゲン受容体遺伝子の突然変異を局在化します。PCR/DGGEを使用して、苦しんでいる個人および潜在的なキャリアの遺伝子の2757-BPコーディング領域の個々のエクソンをスクリーニングしました。いくつかのケースで、変異対立遺伝子の継承が実証されています。（ii）数千のチオグアニン耐性変異体を同時に分析する。ヒトHPRT遺伝子座でのMNNG、ICR-191、およびシスプラチンのin vitro変異スペクトルは、この方法で調べられています。化合物はすべて、エクソン3のGGGGGGシーケンスに変異ホットスポットを持っています。ただし、エージェントによって誘発される特定の突然変異は異なっていました。（iii）PCRで使用されるいくつかのDNAポリメラーゼの忠実度を調べます。Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ（TAQ）の忠実度は、1-2 x 10（-4）誤解/BP/複製です。TAQポリメラーゼの問題は、TAQ誘発エラーがシステムの感度を低下させるため、DGGEによる複雑な変異体集団の分析で発生します。これを回避するには、より高い忠実度を持つ修飾されたT7 DNAポリメラーゼであるシーケナーゼを使用する必要がありました。ただし、シーケナーゼはサーモスタブルではなく、すべてのPCRサイクルを追加する必要があります。Thermococcus litoralis（Vent）の熱安定性DNAポリメラーゼが利用可能になりました。DGGEを使用してPCRのVent、Taq、およびSequenaseポリメラーゼの忠実度を調べました。ベント、Taq、およびシーケナーゼポリメラーゼの忠実度は、それぞれ2.4 x 10（-5）、8.9 x 10（-5）、および4.4 x 10（-5）エラー/BPでした。ベントポリメラーゼは、テストされた3つの酵素の中で最高の忠実度を持っていました。

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) separates DNA molecules based on primary sequence. Under the appropriate conditions, all base pair (bp) substitutions, frame-shifts, and deletions less than about 10 bp can be resolved from the wild type sequence using DGGE. Polymerase chain reaction (PCR) permits facile amplification of a given region of the genome. We have combined PCR and DGGE to: (i) Localize mutations in the X-linked human androgen receptor gene. PCR/DGGE was used to screen the individual exons in the 2757-bp coding region of the gene in afflicted individuals as well as in potential carriers. Inheritance of a mutant allele has been demonstrated in several cases; (ii) Analyze thousands of thioguanine-resistant mutants simultaneously. The in vitro mutational spectra of MNNG, ICR-191, and cisplatin at the human HPRT locus have been examined by this method. The compounds all have mutational hotspots in a GGGGGG sequence in exon 3; however, the particular mutations induced by the agents were different; (iii) Examine the fidelity of several DNA polymerases used in PCR. The fidelity of Thermus aquaticus DNA polymerase (Taq) is 1-2 x 10(-4) misincorporations/bp/replication. Problems with Taq polymerase arise in the analysis of complex mutant populations by DGGE because the Taq-induced errors reduce the sensitivity of the system. To circumvent this, it had been necessary to use Sequenase, a modified T7 DNA polymerase with a higher fidelity. However, Sequenase is not thermostable and must be added every PCR cycle. A thermostable DNA polymerase from Thermococcus litoralis (Vent) is now available, and we have examined the fidelity of Vent, Taq, and Sequenase polymerase in PCR using DGGE. The fidelity of Vent, Taq, and Sequenase polymerase was 2.4 x 10(-5), 8.9 x 10(-5), and 4.4 x 10(-5) errors/bp, respectively. Vent polymerase had the highest fidelity of the three enzymes tested.