[リアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ反応により、46の新たに診断された急性前骨髄球性白血病患者におけるPML/Raralpha遺伝子転写産物の検出]

急性前骨髄球性白血病（APL）患者におけるPML/Raralpha遺伝子転写産物を検出するためのリアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Q-PCR）の適用を調査するために、46人の新たに診断されたAPL患者からの骨髄サンプルは分析のために収集されました。BCR1-、BCR3-form PML/RaralphaおよびABLコントロール遺伝子のcDNAフラグメントを含む3つのプラスミドがそれぞれ構築されました。Taqman蛍光プローブを使用したABI PRISM 7500シーケンス検出システムを使用して、標的遺伝子を定量化しました。PML/raralpha mRNAは、46人のAPL患者と40人の非APL患者のQ-PCRによって検出されました。PML/raralpha mRNAの正規化された商（NQ）は、次のとおりとして計算されました：NQ = PML/RARALPHA mRNAコピー数/ABL mRNAコピー番号。急性前骨髄球球性白血病の免疫表現型は、4色のフローサイトメトリーによって決定されました。結果は、Q-PCRを使用することによる日間アッセイと日内アッセイの変動係数（CV）がそれぞれ1.58％と0.88％であることを示しました。Q-PCRは、100 ng RNAあたりのターゲット遺伝子の5つのコピーを再現性に検出でき、偽陽性の結果は見つかりませんでした。PML/Raralpha mRNAのNQの中央値は、46人のAPL患者で0.450（0.084-1.082）でした。PML/raralpha mRNAタイプと年齢、性別、ヘモグロビン、血小板数、形態またはフローサイトメトリー、PML/raralpha NQ、または臨床的に診断された凝固障害/BLeding疾患の兆候の兆候の兆候によって検出された骨髄におけるプロミエロサイトのプロミエロサイトの割合との相関関係はありませんでした。。BCR1-FORMの症例と比較して、BCR3-formの症例には、より多くのM（3V）表現型（42.9％対9.4％、P = 0.015）およびWBCカウントが高かった（9.35 x 10（9）/l対2.15 x 10（9）10（9）/L、p = 0.038）。APL細胞は、フローサイトメトリーのCD45/SSCヒストグラムで、大きな側散乱集団（L-SSC）および非拡散側散乱集団（NL-SSC）に分類できます。87.50％BCR1-formの患者はL-SSC表現型を示し、BCR3-formの64.29％患者はNL-SSC表現型を示しました。機密性の高いQ-PCRメソッドが確立されていると結論付けられています。PML/Raralpha mRNAのNQの中央値は、新たに診断されたAPL患者で0.450でした。BCR3-FORMとBCR1-FOM APL患者の両方のPML/Raralpha mRNA発現について有意な違いはありませんでした。PML/raralpha転写産物のタイプは、形態と免疫表現型に関連しています。

In order to explore the application of real-time quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (Q-PCR) for detecting PML/RARalpha gene transcripts in patients with acute promyelocytic leukemia (APL), the bone marrow samples from 46 newly diagnosed APL patients were collected for analysis. Three plasmids containing cDNA fragments of the bcr1-, bcr3-form PML/RARalpha and ABL control gene were constructed respectively. The ABI Prism 7500 Sequence Detection System using Taqman fluorogenic probes was used to quantify target gene. PML/RARalpha mRNA was detected by Q-PCR in 46 APL patients and 40 non-APL patients. The normalized quotient (NQ) of PML/RARalpha mRNA was calculated as followings: NQ = PML/RARalpha mRNA copy numbers/ABL mRNA copy numbers. Immunophenotype of acute promyelocytic leukemia was determined by four-color flow cytometry. The results showed that the coefficients of variation (CV) of inter-day assay and intra-day assay by using Q-PCR were 1.58% and 0.88% respectively. Q-PCR could detect reproducibly 5 copies of target gene per 100 ng RNA and no pseudopositive results were found. The median NQ of PML/RARalpha mRNA was 0.450 (0.084 - 1.082) in 46 APL patients. There was no indication of any correlation of PML/RARalpha mRNA type with age, sex, hemoglobin, platelet count, percentage of promyelocytes in bone marrow detected by morphology or flow cytometry, PML/RARalpha NQ, or signs of clinically diagnosed coagulation/bleeding disorders. Compared with bcr1-form cases, bcr3-form cases had more M(3v) phenotype (42.9% vs 9.4%, P = 0.015) and higher WBC count (9.35 x 10(9)/L vs 2.15 x 10(9)/L, P = 0.038). APL cells could be classified into large side scatter population (L-SSC) and non-large side scatter population (NL-SSC) in CD45/SSC histogram of flow cytometry. 87.50% patients with bcr1-form showed L-SSC phenotype and 64.29% patients with bcr3-form showed NL-SSC phenotype. It is concluded that a sensitive Q-PCR method is established. The median NQ of PML/RARalpha mRNA was 0.450 in newly diagnosed APL patients. There was no significant difference about PML/RARalpha mRNA expression of both bcr3-form and bcr1-form APL patients. Type of PML/RARalpha transcripts is related with the morphology and immunophenotype.