抽出のないサンプル調製手順とLC/（APCI）MSに基づくヒト血漿中のメトホルミンとグリベンクラミドの同時アッセイ

メトホルミンとグリベンクラミドの分離は、ゾルバックスCNカラム、アイソクラシック条件下で、アセトニトリルおよび水性成分（0.01モル/l酢酸アンモニウム3.5で酢酸を加えて酢酸アンモニウム）を使用して体積比1/1を使用して、単一のクロマトグラフィー走行内で達成されました。血漿サンプル調製は、有機溶媒添加によるタンパク質沈殿に基づいています。1,3,5-トリアジン-2,4,6-トリミン（IS1）がメトホルミンの内部標準として使用されましたが、グリキドン（IS2）はグリベンクラミドで同じ役割を果たしました。大気圧化学イオン化（APCI）を使用して、イオントラップ質量分析器を使用して検出を行いました。分子イオンに対応するイオンクロマトグラムを抽出することにより、メトホルミンとIS1の検出には、単一のMS段階が使用されました。SRMモードでのMS/MS検出は、グリベンクラミド（494から369 DAへのm/z遷移）およびIS2（528から403 DAへのm/z遷移）に使用されました。このメソッドは、メトホルミンでそれぞれ最大2000 ng/ml、グリベンクラミドでは400 ng/mlまでの線形応答を生成します。メトホルミンでは40 ng/mL範囲、グリベンクラミドでは4 ng/mLレベルで低い定量化が見つかりました。精度は、9％未満の相対標準偏差（RSD％）によって特徴付けられました。分析方法は、コーティングされたタブレットあたり400 mgのメトホルミンと2.5 mgのグリベンクラミドを含む2つの市販の抗糖尿病組み合わせの単回投与、無盲検、無作為化、2期、2つのシーケンス、クロスオーバー生物等価研究に成功裏に適用されました。

Separation of metformin and glibenclamide was achieved within a single chromatographic run on a Zorbax CN column, under isocratic conditions, using acetonitrile and aqueous component (0.01 moles/L ammonium acetate adjusted at pH 3.5 with acetic acid) in volumetric ratio 1/1. Plasma sample preparation is based on protein precipitation by means of organic solvent addition. 1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine (IS1) was used as internal standard for metformin, while gliquidone (IS2) played the same role for glibenclamide. Detection was performed with an ion trap mass analyzer, using atmospheric pressure chemical ionization (APCI). A single MS stage was used for detection of metformin and IS1, by extracting ion chromatograms corresponding to molecular ions. MS/MS detection in the SRM mode was used for glibenclamide (m/z transition from 494 to 369 Da) and IS2 (m/z transition from 528 to 403 Da). The method produces linear responses up to 2000 ng/mL for metformin and 400 ng/mL for glibenclamide, respectively. Low limits of quantification were found in the 40 ng/mL range for metformin and at the 4 ng/mL level for glibenclamide. Precision was characterized by relative standard deviations (RSD%) below 9%. The analytical method was successfully applied to a single dose, open-label, randomized, two-period, two-sequence, crossover bioequivalence study of two commercially available anti-diabetic combinations containing 400 mg metformin and 2.5 mg of glibenclamide per coated tablet.